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    高质量RNA提取条件之一

    点击次数:829 发布时间:2017-08-09

    1.迅速灭活内源的RNA酶,以防止RNA降解。

    以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活:

    1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。

    2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以瞬间令RNA酶失活。

    3)立即将样品置于RNAfixer无液氮RNA样品储存液中。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片要够薄(<0.5cm),这样RNAfixer才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。

    2. 低浓度RNA的沉淀

    纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩,以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀(加0.1体积的5M醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇,-20°C放置25分钟以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNAng/ml),可以采用共沉淀(如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA )的方法。核酸助沉剂是linear acrylamide,当RNA用于RT-PCR分析时,线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂,因为它们都不含DNA污染,糖原含量高会抑制PCR反应。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染,有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后,注意避免RNA沉淀过分干燥,因为这可能导致很难重新溶解。

    3.破壁方法

    细胞或组织的匀浆对RNA提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌、真菌则常常需要更加剧烈的方法,通常用液氮研磨。比如说细菌(特别是革兰氏阳性菌)的细胞壁,就需要溶菌酶消化来实现的细胞裂解和RNA的大回收。酵母和革兰氏阳性菌通常还需要液氮研磨过程中加入玻璃微珠帮助破壁,酵母提取也可以加入诸如Lyticase等破壁酶帮助破壁,再用TRIpureRNApure进行提取。

     

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