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病理实验TUNEL检测

产品介绍

实验原理

TUNEL法(terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法),也称DNA断裂的原位末端标记法。细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300 kb的大片段,然后大约30%的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180~200 bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,再用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与衍生物上生物素结合(每个链霉亲和素至少可以再结合3个生物素分子),最后用DAB、过氧化氢与辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色。

实验流程

(1)收集处理后的细胞或石蜡切片脱蜡至水。

    (2)过氧化氢甲醇中浸洗,抑制内源性过氧化氢酶。

    (3)用蛋白酶K室温孵育15~30分钟。

    (4)滴加TUNEL反应混合液(即配即用,4oC避光),孵育60分钟,在荧光镜下(绿色)分析结果。

    (5)加入转化剂-POD,孵育20~30 min。

    (6)加入DAB底物溶液,孵育5~10 min。

    (7)中性树胶或者甘油封片,光镜下分析结果。

服务说明

(1)客户提供:培养好的细胞以及所需药品;或者提供石蜡标本

(2)公司提供:基本实验步骤、图片、数据分析结果、剩余药品

     (3)实验周期:1周左右,具体需要根据细胞生长情况及实验内容而定。

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