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引物设计与合成实验外包.

产品介绍

                     引物设计与合成实验外包.

一、 引物设计与合成实验外包.原则

聚合梅链式反应(polymerase chain reaction)即PCR技术,是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法,故又称基因的体外扩增法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用多,广泛的手段之一,而引物设计是PCR技术中至关重要的一环,使用不合适的PCR引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱,等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行,可以直接提交模板序列到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计原则如下:

1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。引物序列应位于基因组DNA的高度保守区,且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合,提高反应的特异性;

2、引物的长度一般为15-30 bp。常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;

3、引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行;

4、引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大;

5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T);

6、引物5'端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

7、引物3'端不可修饰。引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。

8、引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加;

9、G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端 G值较低(值不超过9),而5'端和中间 G值相对较高的引物。引物的3'端的 G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应;

值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低,在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。

 服务特点:

1. 提供引物设计的参考序列,设计原理和分析报告,让您对您的引物或探针的性能和特点有一个的了解,便于您对实验结果的认识和分析。

2. 可提供扩增前的与处理及扩增后服务:包括,核酸提取,pcr,核酸纯化,序列分析,数据统计等服务。             

3. 一次的服务,全程的保障。

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