上海Western blot实验

上海Western blot实验

蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
1. 蛋白样品的制备(Protein sample preparation)
    可以选用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行蛋白抽提。
2. 电泳

(1) SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制。

(2) 样品处理

    在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于100℃或沸水浴中加热3-5分钟，以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制。

(3) 上样与电泳

    冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，好使用预染蛋白质分子量标准。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。
    采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求。为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

上海Western blot实验
3. 转膜(Transfer)
    转膜时，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜电流可设定为80V/2H or 10V过一晚。
   在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

4. 封闭(Blocking) 
    转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的悦延生物WB洗膜液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入WB封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高，可以在4℃ 封闭过一晚。在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    参考文献，按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液，不要漂洗，直接加入稀释好的一抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时在再37℃水箱一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过一晚。回收一抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入WB洗涤液，，漂洗3-6次，每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    参考文献，按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入WB洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。洗净洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3-5次，每次5-10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
    检测结果可使用相应显色试剂来检测蛋白，具体使用细节请参考相关文献。.
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
    如果蛋白样品非常宝贵，可以使用悦延生物WB抗体去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
9.您需提供
    需新鲜或正存的蛋白样品或者蛋白粗提液，阳性对照样品（如果有）， 检测目的蛋白的一抗（或由悦延生物代购）。组织样品不少于50mg；细胞不少于5×106个；总蛋白浓度不低于 2μg/μl（至少50μl）。