细胞凋亡实验

细胞凋亡实验：
人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡（apoptosis）。 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着的作用。凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。

细胞凋亡与坏死的区别：
坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞 胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。
凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。

形态学变化：
形态学观察细胞凋亡实验的变化是多阶段的，往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
a，形态学
原理：一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
优点：简单、方便，成本低
缺点：很主观，非常依赖实验者的经验
b，DNA含量

原理：细胞凋亡时,核酸内切酶激活,导致DNA 断裂,这是凋亡的特征性表现,也为FCM 鉴别凋亡细胞奠定了基础。当细胞用乙醇、TrtionX—100 处理后细胞膜上出现漏洞，小片段DNA 从细胞内释放出来,使其DNA 含量低于正常细胞的二倍体。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍体G1峰前出现“亚二倍体"峰，即细胞凋亡峰(APO峰) ,根据APO峰可测出凋亡细胞百分率。
优点：该法简单易行,可大批定量检测凋亡标本,亦可同时分析细胞的细胞周期位置。
缺点：DNA 含量测定在检测细胞凋亡中的局限性在于其特异性和敏感性均不高。特异性不高是因为APO 峰代表了一组细胞群体，包括凋亡细胞、机械损伤细胞、低DNA 含量的细胞或不同染色体结构的细胞，在上述情况下,DNA 与荧光染料的结合量均小。另外，非固定的细胞在低渗溶液中被溶解时，可导致大量的核碎片出现，此时APO 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目，并不代表凋亡细胞数目。敏感性较差的原因是细胞凋亡早期只有DNA 断裂点出现，但尚未出现DNA 片段的大量丢失，所以该法不能检出早期凋亡细胞和发生于S 期或G2/ M 期的凋亡细胞，因为其实际含量不低于二倍体细胞所含的DNA，因此该法进行凋亡细胞分析时应结合其它形态或生化方法，以期更准确地分析细胞的凋亡状态。
c，AnnexinV/PI

原理：PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。
优点：细胞凋亡时膜上PS 外露早于DNA 断裂发生,因此该法检测早期凋亡更为灵敏，且该法不需要固定细胞，避免了PI 法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA 片段丢失，因此更加省时，结果亦更可靠，是目前为理想的凋亡定量检测方法。
缺点：检测早期凋亡更好，好与其他检测晚期凋亡的方法结合使用，对检测试剂、仪器要求较高。
d，线粒体膜电位
原理：在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。

优点：采用荧光的检测方法，放大了凋亡信号，灵敏度高。
缺点：不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

e，TUNEL

原理：由于内源性核酸内切酶激活,细胞自身的染色质或DNA 被切割，并产生与DNA 断点数目相同的3’ 羟基末端，TdT 可以将生物素化的dUTP 标记至3’ 羟基末端，通过卵白素2FITC 系统，使DNA 的断点部位发生特异荧光而签别出凋亡细胞。但由于断裂DNA 的标记过程比较复杂，涉及多种因素，所以末端标记的阴性结果并不代表DNA链的完整，应排除方法上的问题，如TdT 酶活力的丧失等诸多影响因素。因此应用TdT 末端标记法鉴别凋亡细胞同时设阳性及阴性对照组，以便得到可靠结果。
优点：TdT末端标记法是鉴别凋亡细胞比较特异的一种方法
缺点：标记过程比较复杂，涉及多种因素，实验成败受试剂质量、操作手法影响较大。

f，Caspase-3/7
原理：Caspase-3是细胞凋亡过程中主要的终末剪切酶，Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成。Caspase-3主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。在细胞凋亡启动时，116kD的PARP在Asp216-Gly217之间被caspase-3剪切成31kD和85kD两个片段，使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能。结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡。可以通过Western blot，酶活性检测，流式细胞术等技术检测Caspase 3/7的活性与表达。
优点：Caspase 3/7活性检测，可检测的方法学较广，灵敏度较高。
缺点：需要和下游PARP的检测，同时验证。

g，PARP

原理：PARP，即poly(ADP-ribose) polymerase，是定位在细胞核内，和应激条件下DNA修复密切相关的一种酶。PARP在体外可以被多种Caspase剪切，在体内是Caspase 3的主要剪切对象。对于人PARP，在Asp124和Gly215之间被Caspase剪切后，使PARP羧基端的催化结构域(89kD)和氨基端的DNA结合结构域(24kD)相分离，从而使PARP失去其酶活力。PARP对于细胞的稳定和存活非常重要，PARP失去酶活力会加速细胞的不稳定。PARP剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是Caspase 3激活的指标。
优点：检测方法常规可信，凋亡特异性高
缺点：不能检测凋亡早期

服务说明：
1. 凋亡检测方法可由客户，也可由我们推荐，后由客户抉择；
2. 凋亡实验涉及的细胞、药物，可由客户提供，也可查看公司的产品库，亦可由我们代购；
3. 凋亡实验建议选择2种不同的方法相互验证。
提交的产品和资料：
实验报告

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