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线粒体膜电位的检测

产品介绍

线粒体膜电位的检测

1. JC-1 染色工作液的配制
   六孔板每孔所需JC-1 染色工作液的量为1mL,其他培养器皿的JC-1 染色工作液的用量以此类推;对
于细胞悬液每50~100 万细胞需0.5mL JC-1 染色工作液。取适量JC-1(200×),按照每50μL JC-1(200
×)加入8mL 超纯水的比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色缓冲液
(5×),混匀后即为JC-1 染色工作液。

线粒体膜电位的检测
2. 阳性对照的设置
   把试剂盒中提供的CCCP(10mM)推荐按照1∶1000 的比例加入到细胞培养液中,稀释至10μM,处
理细胞20 分钟。随后按照下述方法装载JC-1,进行。对于大多数细胞,通常10μM CCCP
处理20 分钟后线粒体的膜电位会丧失,JC-1 染色后观察应呈绿色荧光;而正常的细胞经JC-1 染色后
应显示红色荧光。对于特定的细胞,CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同,需自行参考相关文献资
料决定。
3. 对于悬浮细胞
(1) 取10~60 万细胞,重悬于0.5mL 细胞培养液中,细胞培养液中可以含血清和酚红。
(2) 加入0.5mL JC-1 染色工作液,颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 分钟。
(3) 在孵育期间,按照每1mL JC-1 染色缓冲液(5×)加入4mL 蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 染色
缓冲液(1×),并放置于冰浴。
(4) 37℃孵育结束后,600g 4℃离心3~4 分钟,沉淀细胞。弃上清,注意尽量不要吸除细胞。
(5) 用JC-1 染色缓冲液(1×)洗涤2 次:加入1mL JC-1 染色缓冲液(1×)重悬细胞,600g 4℃离心
3~4 分钟,沉淀细胞,弃上清。再加入1mL JC-1 染色缓冲液(1×)重悬细胞,600g 4℃离心3~
4 分钟,沉淀细胞,弃上清。
(6) 再用适量JC-1 染色缓冲液(1×)重悬后,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光
分光光度计检测或流式细胞仪分析。
4. 对于贴壁细胞
注意:对于贴壁细胞,如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测,可以先收集细胞,重悬后参
考悬浮细胞的检测方法。
(1) 对于六孔板的一个孔,吸除培养液,根据具体实验如有可以用PBS 或其它适当溶液洗涤细胞
一次,加入1mL 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
(2) 加入1mL JC-1 染色工作液,充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 分钟。
(3) 在孵育期间,按照每1mL JC-1 染色缓冲液(5×)加入4mL 蒸馏水的比例,配制适量的JC-1 染色
缓冲液(1×),并放置于冰浴。
(4) 37℃孵育结束后,吸除上清,用JC-1 染色缓冲液(1×)洗涤2 次。
(5) 加入2mL 细胞培养液,培养液中可以含有血清和酚红。
(6) 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
5. 对于纯化的线粒体
(1) 把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1 染色缓冲液(1×)稀释5 倍。
(2) 0.9mL 5 倍稀释的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10~100μg 纯化的线粒体。
(3) 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描(time scan),
激发波长为485nm,发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪,激发波长不能设置为485nm 时,
可以在475~520nm 范围内设置激发波长。另外,也可以参考下面步骤6 中的波长设置进行荧光检
测。
(4) 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察:方法同下面的步骤6。
6. 荧光观测和结果分析
   检测JC-1 单体时可以把激发光设置为490nm,发射光设置为530nm;检测JC-1 聚合物时,可以把激
发光设置为525nm,发射光设置为590nm


注意:此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在大激发波长和大发射波长。如使用荧光显微
镜观察,检测JC-1 单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置,如观察GFP 或FITC 时的设置;检测JC-1
聚合物时可以参考观察其它红色荧光,如碘化丙啶或Cy3 时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降,
并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常,细胞的状态也比较正常。
保存条件:
-20℃避光保存,尽量避免反复冻融,有效期一年。
超纯水和JC-1 染色缓冲液(5×)也可4℃保存。
注意事项:
1. JC-1(200×)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可以20~25℃
水浴温育片刻至全部融解后使用。
2. 先把JC-1(200×)用试剂盒提供的超纯水充分溶解混匀后,才可以加入JC-1染色缓冲液(5×)。
不可先配制JC-1染色缓冲液(1×)再加入JC-1(200×),这样JC-1会很难充分溶解,会严重影响后续
的检测。
3. 装载完JC-1后用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤时,使JC-1染色缓冲液(1×)保持4℃左右,此时的洗涤
效果较好。
4. JC-1探针装载完并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
5. 请勿把JC-1染色缓冲液(5×)全部配制成JC-1染色缓冲液(1×),本试剂盒使用过程中需直接使用JC-1
染色缓冲液(5×)。
6. 如果发现JC-1染色缓冲液(5×)中有沉淀,全部溶解后才能使用,为促进溶解可以在37℃加热。
7. CCCP为线粒体电子传递链抑制剂,有毒,请注意小心防护。
8. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
 

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