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    免疫荧光技术详解,技术大放送

    点击次数:1984 发布时间:2017-09-19

    一. 免疫荧光简介

    免疫荧光(immunofluorescence)技术是在免疫学,生物化学和显微技术的基础上建立的一项技术,再用荧光抗体(或者)抗原作为探针检测细胞或组织内相应的抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光在细胞或者组织的表达,从而确认抗原或抗体的性质和定位。常用的方法有直接法和间接法。

     

    二.实验步骤

    1、细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

    2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞,固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月;

    3、通透。目的:以抗体能够到达抗原部位。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理,但是对于核内抗原可能无效,需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时,要注意它会引起细胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外,细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透,可以避免去垢剂的使用。

    透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

    4、封闭。为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用0.5%BSA或血清(与二抗来源一致 如 一抗为兔抗,二抗为山羊抗兔,那么封闭液就用山羊血清)封闭,减弱背景着色。

    血清封闭的时间是可以调整的,一般为30min。

    5、一抗结合。吸净山羊血清,室温孵育1h或者4℃过夜。

     

    6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。

     

    7、封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。

     

    三.注意事项

    1、经荧光染色的标本好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

    2、二抗用之前离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。 

    3、整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

    4、要单独冲洗,防止交叉反应造成污染;要温柔冲洗,防止切片的脱落;冲洗的时间要足够,才能洗去结合的物质。

    5、加入荧光抗体后要记得避光!!!每次试验时 ,建议设置以下三种对照:

    阳性对照:阳性血清+荧光标记物

    阴性对照:阴性血清+荧光标记物

    荧光标记物对照:PBS+荧光标记物

     

    6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。 

    7、细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可,之后片子可保留更长时间。

     

    四.主要应用

    免疫荧光技术应用范围极其广泛,可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别,又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。

     

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