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    反向PCR实验

    点击次数:1132 发布时间:2017-08-22

    nverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多,而Inverse-PCR一般只要有特异条带,基本上就是目的片段。

    基本步骤如下:

    1、反向PCR(Inverse PCR)原理:反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。

    a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界(左边界、右边界均可)和酶切位点附近设计引物P1、P2;

    b. 回收DNA,T4连接酶连接,使酶切后的DNA片段环化;

    c. 回收连接后的DNA,用引物P1、P2做PCR,就可扩增到两端为T-DNA插入序列,中间为侧翼序列的片段。

    2、限制性内切酶消化:选择合适的限制性内切酶,基因组要切成弥散性的条带。在酶切之前,应对基因组DNA定量。

    根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI,BamHI和HindIII/PstI,并在酶切位点上游附近设计引物Z1,Z2,Z3和Z4,然后用这些内切酶分别消化基因组DNA, 37度 过一夜,电泳检测酶切效果。

    3、回收DNA

    ① 将酶切产物转到1.5ml离心管中,用ddH2O洗涤干净,并稀释到250μl;

    ② 加入等体积的酚和CHCl3(V:V=1:1),涡旋混匀,室温静置1min;

    ③ 大速度(13, 000 rpm)离心1min;

    ④ 将上清移到另一管中,加入等体积的CHCl3,涡旋混匀,室温静置1min;

    ⑤ 大速度(13, 000 rpm)离心2min;

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