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    血清免疫法诱发肝纤维化模型

    点击次数:789 发布时间:2018-02-02

    血清免疫法诱发肝纤维化模型

    (1)复制方法  Wistar大鼠,雌性,体重为120~150g,分别在第1, 15, 25, 35日同剂量皮下多点注射人血清白蛋白4mg/只,人血清白蛋白用生理盐水稀释并与等量的不福氏佐剂乳化。在末次免疫后10d取血测抗体,选取抗白蛋白抗体阳性者,于尾静脉攻击注射白蛋白,每周2次。其中,第1周静注2.5mg/只,以后每次攻击注射增加0.5mg/只,直至4.5mg/只,并维持该剂量至少2个月;或第1、3次为8mg/只,余均4mg/只,共9次,同时在攻击注射前1d开始皮下注射前列腺素E1(PGE1)0.2mg/次,每日2次,直至造模结束。或腹腔注射猪血清0.5ml/只,或成年猪新鲜无菌混合血2ml/只,每周2次,连续10周,停止注射后继续观察10周。造模期间,每日观察动物的一般情况。每周称重一次。免疫攻击结束和随后的观察期间,在不同时点抽取全血制备血清、摘取肝脏制备组织匀浆作免疫复合物及生化检测,并按光镜和电镜要求,分别取材、固定、包埋及切片,连续石蜡切片分别染以HE、VG和甲苯胺蓝,行组织形态学检查,冰冻切片供免疫荧光法作肝内IgG和补体C3检测。

    (2)模型特点  人血清白蛋白2.5~4.5mg皮下攻击注射后10周时,模型动物约80%可形成程度不等的纤维化乃至肝硬化,死亡率为20%~30%,而4~8mg攻击注射加 PGE1皮下注射保护后30d时,模型动物亦可形成肝纤维化,死亡率仅为5%。攻击注射早期,肝脏组织结构大致正常,但贮脂细胞增生活跃;注射中期,血清C3含量明显下降;后期,界板区肝细胞变形坏死,炎症细胞浸润,汇管区及小叶间纤维组织增生,肝胶原含量上升至较高水平,肝窦、血管壁、结缔组织以及肾小球荧光染色阳性,血清C3含量由下降状态逐步回升并超过正常。猪血清连续攻击注射7周,模型动物血清和组织匀浆透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)含量升高;攻击注射10周,肝组织汇管区扩大,纤维增多,并向小叶内伸展,与邻近汇管区及肝静脉相连,分割包绕肝实质,汇管区及间隔内基质成分增多,细胞成分减少,形成以细胞外基质(ECM)沉积为主的纤维间隔,间隔细胞大多为核瘦长而深染的纤维细胞;造模15周时,肝组织结构基本同10周时状况,汇管区及间隔内细胞成分更少;造模20周时,少数动物肝内部分纤维间隔变细或断续消失。除上述梭形间质细胞外,在汇管区及间隔内,尚见酸性粒细胞(Eos)浸润,连续攻击注射8周达高峰,10周末以后逐渐下降,20周时汇管区仍可见少量Eos。免疫荧光显示,连续攻击注射8周时,模型动物除血管壁和窦壁IgG和C3阳性增强外,其间质内亦呈阳性,呈大量丝状、索状分布;10、15周末,IgG和C3弥漫分布在间隔及汇管区间质内,阳性进一步增强;20周末间质和窦壁的IgG和C3减弱。猪新鲜无菌混合血连续攻击注射10周,模型动物肝纤维间隔形成,且较为纤细,10~14周时,纤维间隔逐渐增粗,肝组织分隔严重,假小叶形成较多、面积较小,这种变丶化态势一直延续至20周。

    (3)比较医学  人类肝纤维化是一种病因复杂的临床综合征,是慢性肝炎发展为肝硬化的必经阶段。尤其是各型病毒性肝炎和某些肝病,免疫因素诱发而成的肝纤维化为其主要病理特征。人或异种动物血清进入体内,其中的白蛋白和大分子物质作为异种抗原刺激机体产生相应的抗体,当抗原再次进入机体则会形成抗原一抗体免疫复合物(IC),后者在肝脏主要是在门脉汇管区及中央静脉周围沉积,引起局部炎性反应,激发贮脂细胞增生,并向成纤维细胞转化,进而分泌胶原纤维,造成肝组织纤维化。同时,异种血清可能引起肥大细胞介导的Ⅰ型变丶态反应中迟发相反应(LPR),吸引大量Eos浸润,通过其释放的一些物质如肝组织中转化生长因子β1(TGF-β1)等使原始间质细胞(PMC)和肝星状细胞(HSC)激活、衍生并合成大量ECM,从而使组织内ECM过渡沉积而导致肝纤维化。本模型的主要特点是成模动物肝纤维化病理形态稳定,停止攻击注射后,对先前形成的肝纤维组织自然再吸收程度较轻,肝纤维化形态维持时间可达数个月,在致纤维化的过程中有贮脂和成纤维细胞参与,且对肝细胞损伤较轻。虽然本模型在对肝细胞损伤方面有别于肝炎后肝纤维化及肝硬化,但鉴于目前用肝炎病毒尚不能复制成可供实验用的肝纤维化模型,而本模型系免疫损伤所致,故结合CCl4诱导的肝纤维化动物模型来综合研究和评价以病毒性肝炎为主要病因的慢性肝病肝纤维化的发病机理,也许是一种较为可行的方法。有学者对人血清白蛋白诱发大鼠肝脏纤维化模型的实验方法学进行了系统的研究,发现造模选用动物的机体免疫状况、造模环境以及预防免疫反应过激导致动物死亡对造模成功率具有极其重要的影响,认为选用6周龄大鼠在(22±1)℃环境条件下进行模型复制是比较适宜的,其中每日皮下注射PGE1是其技术关键。除人和猪血清外,还可用牛血清白蛋白复制免疫性肝纤维化动物模型。

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