神经根慢性嵌压损伤动物模型

神经根慢性嵌压损伤动物模型 

脊髓退行性病变等引起的神经根嵌压伤，是一个慢性损伤过程。其主要表现为椎间盘突出、关节突增生、黄韧带肥厚等，继之造成神经根受压，引起相应症状。因此，建立接近神经根在神经通道内受压的动物模型，进行各项研究指标的观测，有利于了解疾病的发生、发展及探索有效的临床治疗方法。现在已有大量动物模型用于研究神经根受压后的变化，常用的造模动物有狗、猪、家兔、大鼠等，施加压迫所用的材料亦各不相同。

1 自身骨性增生法(caused by self-bone hyperplasia)

(1)复制方法

1)手术操作  健康家猫，体重为3～5kg，雌雄不拘。经耳缘静脉注射硫喷妥钠(25mg/kg体重)麻醉后，俯卧位固定，剪除手术区域毛发，局部皮肤消毒，无菌操作。分别在下颈段和腰段做正中切口，显露右侧C7、C8、L5、L6神经根及椎间孔内口，用牙髓钻破坏椎间孔周围骨皮质后，将咬除的棘突剪成3mm×10mm的骨条，在中间处对折呈“V’形骨块，从椎间孔内口向外，沿骨壁嵌于神经根通道的骨性管道内及侧隐窝后方，左侧做正常对照。术后给予抗感染治疗3d(按每只2万 U/d肌肉注射庆大霉素或按50mg/kg体重腹腔注射头孢唑啉钠)。观察动物术后的一般情况、肢体运动和肌力状态。

2)检测内容与方法

①影像学和MEP检测  在造模术前和术后的2, 4, 8, 12, 24周将实验动物于麻醉下行X光平片和CT检查，以确定手术处神经根通道的狭窄程度和神经根受压状态。同时进行MEP(磁刺激运动诱发电位检测)检测，刺激位点：脊髓点，C8～T1或L5～6棘突之间；周围神经丛点为ErB'S点，在T1棘突与同侧前肢远端连线上，距T1棘突5cm处。接收电极置于相应靶肌肉肌腹表面，接地电极置于刺激点与接收点之间。

②病理组织学检查  动物在做神经根病理取材时，需观察神经根受压状态和椎间孔大体形态。用游标卡尺测量椎间孔截面积，并与对照侧比较；HE染色在光镜下观察神经纤维轴突、髓鞘、神经膜细胞、神经膜等的改变程度；碳酸锂－苏木素髓鞘特殊染色观察髓鞘情况；透射电镜观察神经纤维、髓鞘的超微结构变化。

(2)模型特点

1)行为学症状及影像学和MEP检测  术后2～5d动物实验侧肢体跛行，肢、腕和膝、踝呈届曲位，不能负重，被动牵拉出现痛苦状挣扎。10d后症状可减轻或消失，于4～6周上述症状再现。8周时出现不同程度的肌萎缩，对刺痛的躲避反射减弱。至12周时，部分动物肢体远端可出现溃疡。 X光平片和CT检查显示，2周左右时，植入骨边界清楚，神经根管明显较对侧狭窄。随着时间的推移，植入骨块周边密度降低，边界模糊，椎间孔周围骨皮质密度增高，呈增生反应。植入骨周围及椎间孔处有骨痂形成，神经根管狭窄。 MEP检测显示，随着病情的进展，出现脊髓刺激点和ErB's点诱发电位潜伏期延长，波幅降低，波形分化不清和双峰波等异常现象。

2)病理组织学检查  ①HE染色显示：随着病程的进展，表现为神经束膜、内膜水肿，部分髓鞘发生肿胀和无髓纤维变形。神经外膜增厚，可发生节段性脱髓鞘改变。神经纤维轴突发生节段性增粗、断裂，远端发生勒瓦氏变性。随后变性的神经纤维结构崩解、吸收、形成空洞，增生的结缔组织使整个神经干纤维化。②髓鞘特殊染色显示：随着损伤程度的加重，染色由深蓝变为淡黄色，髓鞘变薄，数量减少。③透射电镜显示：髓鞘结构变形，内层向轴突内突出。在受损髓鞘周围，均可见增大的神经膜细胞核，线粒体、滑面内质网、粗面内质网和高尔基体等明显增殖。

(3)比较医学  该模型采用椎间孔内自体松质骨植入，操作简单、费用低廉、重复性好、成功率高。利用自体骨的增生和炎性粘连反应在椎间孔内和侧隐窝处嵌压神经根，使损伤部位、形式和病理过程与临床更为接近。同时，也避免了由于异物植入反应对实验结果造成的混杂因素。该模型的病理表现是一个渐进的过程，由直接受压处开始逐渐向远端发展，并引发周围神经的一系列改变，在同一神经干中可并存几种不同程度的损伤形式。无髓的感觉神经纤维变性明显早于有髓的运动神经纤维，这与临床神经受压先出现感觉障碍而后影响运动功能相吻合。其病理学的改变也显示了神经在慢性损伤过程中各阶段的病理特征，可为相关实验提供较可靠的动物模型。

该方法还可适用于脊髓各段神经根造模，嵌压范围可按需把握。

2 腰骶神经压迫法(nerve lumbar-sacrum oppression)

常用的造模动物有狗、猪、家兔、大鼠等，施加压迫所用的材料亦各不相同。下面综合介绍几种对不同动物腰骶神经的慢性压迫法。

(1)复制方法

1)狗  Delamarter等将粗2.8mm的尼龙电缆线套住狗的马尾神经，使硬脊膜囊缩窄50％～75％，产生马尾神经受压的效果可持续压迫数天～数个月。经检查皮质诱发电位、微血管结构和组织病理学方面的改变，认为缩窄50％是关键，压迫>50％时将出现神经功能障碍和组织学改变。 Yoshizawa暴露狗的第7腰神经根2.5～2.8cm，将长5mm、内径3mm(比神经根直径稍粗)的硅胶管纵行切开套在神经根上，用7～0的尼龙线捆扎套管。观察放置套管后24h、14d、1个月、6个月和12个月神经根的组织形态学、电生理学及血－神经屏障的变化。

此模型的病理机制与临床具有相似性，硅胶管轻微活动引起的刺激破坏了神经根血－神经屏障，加上硅胶管内围绕神经根产生的增生瘢痕，共同导致了神经根内水肿，前者是产生功能障碍的主要原因。

2)猪  猪的脊髓终止于第2骶椎水平。骶1背根神经节一半位于神经根管内，另一半位于椎管内，马尾神经和下位骶神经根的脉管结构与人相似。Cornefjord将原用于制作冠状动脉慢性闭塞模型的Ameroid缩窄器套在猪的骶1神经根周围和背根神经节的近端制作慢性压迫模型。该缩窄器长5.5mm，外层为一刚性金属壳，内层为吸水后可膨胀的酪蛋白衍生物。观察不同内径的缩窄器对神经根引起的解剖形态及神经生理学改变。认为3.5mm为适内径，能逐渐缩小，3周后固定于3.0mm，可达到缓慢压迫神经根的目的。但神经根所受的压迫不是直接由缩窄器自身产生，而是因术中的积血在神经根周围形成肉芽组织机化为瘢痕，瘢痕组织对神经根产生直接压迫效应。

该模型的优点是能使压迫渐进发生，具有重复性和可控性，可产生慢性不性神经根损伤。

3)兔  兔的脊髓圆锥位于L7～S1水平。Toh特制了长度为20mm的“H”型不锈钢金属夹，将顶部和底部的空缺用来放置S2和S3的棘突，横形的中间部有一直径为3mm的可调旋钮，用来压迫兔腰骶部马尾区的硬膜囊和神经根。压迫可分3级，通过X线摄片进行调整：1级，旋钮插入椎管前后直径的1/9；2级，插入2/9；3级，插入1/3。压迫可在1个月内一次完成，也可在1个月与2个月后渐进增加压迫级别完成。

该装置为能通过脑脊液施加量化的神经压迫技术。

4)大鼠  大鼠经济、易于管理、腰骶丛和人相似，是除狗、猪、兔等大动物以外的较为合适的实验用小动物。

大鼠的脊髓终止于L3～4水平。学者们采用不同的材料压迫腰骶神经根，使之产生慢性压迫症状。Kawakami将4根长0.3cm的4/0铬制肠线放在实验大鼠的腰4～6神经根周围，另用2根肠线松散环扎固定，对照组大鼠用2根4/0的丝线松环扎固定模型，观察神经根受激惹后不同时期(1, 2, 3, 4, 6, 8, 10和12周)的病理生理改变和行为变化。虽然铬制肠线和丝线均可使粗髓纤维减少，出现相同组织学改变，但只有铬制肠线组才出现痛觉过敏现象；周跃等改用骨蜡局部固定铬制肠线，操作简单、损伤小，具有压迫止血作用，术后也出现了痛觉过敏表现；Yamaguchi将一厚0.3mm、面积为3.5mm2的约占椎管横截面37％的聚硅酮薄片插入大鼠腰4椎管内，覆盖硬脊膜管的背侧，制作腰椎管狭窄的实验模型。观察马尾神经慢性受压24周后形态和行为方面的改变，发现轴突存在持续的退变和再生现象；Yabuki取大鼠尾端的自体髓核，将其移至背根神经节近端的L5神经根处。对照组取同体积的自体肌肉组织以同样的方法移至神经根处，观察大鼠背根神经节和后爪血流的变化。发现髓核移植组背根神经节内流体压力增加，神经根和后爪的血流量减少，肌肉移植组未发生血流量变化。由于背根神经节内不存在血一神经屏障，因而认为其交感活性增强，出现异常兴奋并通过躯体交感反射引起上述变化，是椎间盘突出引起根性疼痛发病的重要原因。

髓核自体移植可用于研究神经根受压时的炎性损伤效应。

以上四种动物慢性压迫模型尚存在下述缺点：①均须手术施行部分椎板切除，手术操作较复杂，局部创伤大，破坏周围组织结构。②对神经根压迫程度不易控制，难以量化。③与神经根在神经通道内的压迫不相符，临床上压迫缓慢发生，神经根在神经通道内靠椎管内的韧带固定，当其受到压迫时，有的缓冲余地，程度和力量不断变化。④存在机械、炎症、流体力学等不同的混杂干扰因素。

(2)实验观察

1)组织形态学观察

①光镜观察神经慢性压迫的早期表现为：神经根的硬脊膜和蛛网膜变厚，神经内膜间隙明显充血、水肿和出血，伴有部分神经细胞肿胀、坏死和脱髓鞘样改变，而神经纤维尚未发生变性反应；压迫4周后，充血、出血和水肿明显减轻，而以神经纤维的脱髓鞘样改变、纤维细胞增生为主，有明显的炎症反应，神经纤维发生明显变性。主要表现为大直径有髓纤维数量明显减少，而小直径无髓纤维数量相对增多，轴突的体积和髓鞘明显萎缩，神经外膜和神经内膜纤维化样改变，胶原纤维明显增多。

②电镜观察显示：髓鞘板层结构呈点状松散，板层结构排列疏松、紊乱和肿胀并挤突，轴突呈不规则样改变，轴浆内细胞器密集。血管通透性显著增加，神经膜细胞分泌功能增强。神经细胞内线粒体明显肿胀，嵴排列紊乱和消失，呈空泡样改变。核周粗面内质网减少，胞核呈颗粒样改变，溶酶体多见，游离核糖体增多。胞浆内含有较多的呈空泡样改变的粗面内质网、滑面内质网和扩张的高尔基扁平囊泡。细胞核膜出现“裂隙”样改变。

2)电生理学检测  压迫3个月后，复合动作电位的振幅明显降低，与早期粗有髓纤维数量的减少相一致；12个月后，复合动作电位的振幅和感觉神经的传导速度都明显下降。复合动作电位可灵敏反映神经根变性时粗有髓神经纤维的减少情况，但只要还存在粗有髓神经纤维，神经传导速度就不会下降；脊髓诱发电位(SEP)的潜伏期(N1和P1波)明显延长。用铬制肠线炎性损伤后1周时潜伏期无显著变化，2～4周后SEP的潜伏期明显缩短，8周后延长。将刺激电极放在胫后神经和正中神经处，参考电极放在耳和鼻处，记录标准的经皮层诱发电位曲线N1-P1-N2，发现潜伏期明显缩短，波宽显著延长，此项检查能在出现症状之前就检测出神经系统的异常。

3)血液动力学观测

①背根神经节和后爪血流量的研究：Yabuki使用双通道激光多普勒流速计监测血流，将血流量稳定15min的恒定值作为基准，每隔5min记录一次，持续3h。发现髓核移植组背根神经节和同侧后爪的血流量明显减少。

②血－神经屏障的研究：采用EBA与Gd-DTPA的混合剂作为示踪剂，通过MRI影像与荧光显微镜观察神经组织内的分布情况，在受压超过1个月时神经根内可见明显的 EBA外渗现象。用HRP作为示踪剂，在电镜下可见受压时间>1个月的神经纤维内膜腔存在HRP外渗现象，毛细血管内皮细胞紧密连接被破坏，出现HRP产物的胞饮小泡。跨细胞运输示踪剂的异常现象表明血－神经屏障的破坏导致了神经根水肿的形成，但蛛网膜渗漏屏障未受到破坏。

4)生化检测  采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定脑脊液中的蛋白标记物，包括总蛋白、神经丝蛋白轻链、S-100蛋白、神经特异性烯醇酶和神经胶质原纤维。在神经根压迫后1周，脑脊液中神经丝蛋白和总蛋白的浓度明显增高。脑脊液中的蛋白标记物能灵敏反映神经根受压后轴突损伤在脑脊液中的生化改变，是有用的检测手段。

5)分子生物学检测

①炎性因子的基因表达：采用RT-PCR技术检测炎性因子TNF，IL-1β，IL-6，IL-10的mRNA表达。可见压迫术7d后IL-1β，IL-6mRNA明显升高，术后14d TNF的基因表达显著增高，术后1L-10表达持续升高，45d达高峰。认为IL-1β、TNF可导致神经纤维退变和脱髓鞘改变， IL-10与痛觉过敏的产生有关。

②神经元细胞凋亡：神经根受压后由于瓦勒变性和逆行性退变，脊神经节内神经元的胞体可发生损伤反应，出现溃变、死亡。已证明神经损伤后神经元的死亡过程与程序性细胞死亡相同，脊髓运动神经元和背根神经节感觉神经元均可出现凋亡细胞。

③GAP-43表达的变化：生长相关蛋白(GAP-43)是一种膜磷脂蛋白，富含于再生过程中的神经元轴突与生长锥中，其消长的变化可作为判定周围神经损伤程度及再生速度的一项客观指标。周围神经无论是挤压还是切断性损伤之后，神经元都能加速合成及转运GAP-43，待神经合成后便开始向下调控。研究表明，坐骨神经压榨伤后1～2周， GAP-43mRNA急剧升高，4周达高峰，7周恢复正常。

6)神经行为观测

①运动功能的观察：采用肉眼观察动物步态的方法，按功能障碍的程度不同分级。压迫术后动物出现不同程度的垂足现象；用活动平板踏车测试动物行走持续时间，观察在以2.4圈/s转动以及每30s增加一倍转速的转杆上，记录动物摔落的时间。神经根受压动物行走持续时间明显下降。

②无害性热刺激和机械疼痛刺激的定量测定：可采用50W热辐射灯作为热刺激源直接照射动物肢体，用秒表记录肢体回缩反应的潜伏期；用具有不同折弯强度的von Frey单纤维丝(0.976～46.54gf，克力)刺激动物肢体，当某根单丝刺激肢体发生回缩反应时，该单丝的折弯强度即为机械刺激强度值。比较两侧肢体，当患侧数值大于健侧时，表示感觉减退。小于健侧时，表示感觉过敏。动物压迫术后出现热觉过敏和机械觉减退的现象。