脑缺血的观察及脑缺血模型的评价方法

脑缺血的观察及脑缺血模型的评价方法

缺血性脑血管疾病是一个复杂的病理生理过程，评价脑缺血的指标各种各样，研究中选取何种指标评价脑缺血的程度及药物的疗效尤为重要，现将主要的参考观察指标综述如下。

1.神经症状及体征的评价

脑损伤后出现相应的症状与体征，症状与体征的检测又可以反映脑损伤与恢复的程度。常见的分级方法有：Bederson三级法、改良的Bederson、Zealonga 5分制评分法、 Tatlisumak 6分制评分法等。

常用的Bederson按受损程度分级，正常(0级)：①未见活动异常，大鼠被提尾悬空时两前肢向地面伸直。②置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10cm，手感左右推动阻力相等；中度(1级)：①大鼠被提尾悬空时，脑缺血对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直等。②基本同0级；重度(2级)：①同1级。②检查方法同上，但缺血半球对侧的侧向推动阻力明显降低。

Zealonga的5分制评分标准为：0分，无神经损害的症状；1分，不能伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。

症状与体征的检测方法直接、简便，从整体上反映损伤程度，不需要特殊仪器，但人为心理因素比较多，只需随机测定，可靠程度低，可以用做初步筛选或辅助性指标。

2.定位记忆能力的评价

记忆是复杂的生理过程，在多重记忆系统中不同记忆系统有着不同的功能定位、神经环路、递质系统和分子生物学机制。鼠脑缺血后伴有不同程度记忆力与空间定位的障碍，检测的方法可采用：跳台实验、避暗实验、定向游泳实验、 Morris水迷宫实验等。

3.脑电图(EEC)

EEC提供了一种非创伤性研究脑的电活动，可以反映阻断动脉的缺血区与非缺血区以及对侧相应部位的脑电变化，通过生物电的角度从整体上分析脑损害与脑电图的关系。在大鼠冠状缝前相当于皮质感觉运动区(额顶区)部位和顶叶后部(顶枕区)的左右两侧对称地分别放置脑电极各一个，电极穿过颅骨接触硬脑膜，用牙科黏合剂固定，参考电极安置在鼻骨正中。八道生理记录仪记录。若应用脑电图仪，可放置更多的电极，更能准确地反映脑缺血的范围及其程度。缺血区脑电图出现波幅降低，频率减慢。

EEC检测虽然易受外界条件的干扰，但它敏感、价廉、创伤少，故仍不失为一种比较好的检测方法。

4.脑梗死面积及含水量测定法

(1)梗死面积测定  实验证明大鼠动脉阻塞后3～4h梗死就可以达到大范围，测定脑梗死的面积，应在术后4h以后进行。做脑切片，采用TTC(氯化三苯基四氮唑)染色显示梗死的脑组织(粉红色区为正常脑组织，白色为梗死区)。梗死脑组织的测定方法可有：①应用透明纸描叙出每个切面两面的外轮廓及梗死区。②应用坐标法、落点求积法等测量每片梗死区截面积和全脑截面积，计算梗死面积百分比。③可采用数码相机拍照，输入计算机，用图像处理软件计算梗死面积。④梗死范围法：染色后，将白色脑组织挖下称重，以梗死组织的质量占总脑质量百分比作为脑梗死范围。

本方法客观简便，但是敏感度不高，肉眼观察值误差比较大，梗死区域的界限难以地确定。

(2)脑含水量测定  脑水肿是脑缺血不可避免的后果，早期脑水肿的减轻与控制可明显地降低死亡率与致残率，因此脑水肿的机制在不同缺血模型中被广泛地检测与研究。检测的方法有：①直接法：断头取脑，分别称量左右脑片湿重，烘烤至恒重，按脑水肿公式计算。②间接法：采用光镜与电镜观测脑水肿组织、细胞与正常的脑组织、细胞的差别，以反映脑水肿的程度。

公式1  含水量＝[(湿重－千重)/湿重]×100％

公式2  含水量的变化＝[(右脑含水量－左脑含水量)/左脑含水量]×100％

本测定方法操作简单，能够客观地反映脑水肿的程度，与面积法相互结合使用更佳。

5.软脑膜微循环观察

此法可以直接观察软脑膜微循环血液的灌流状况，结合的微循环图像处理系统可直接测量微血管的管径及血流速度。方法为在大鼠颞顶部制作颅窗(颅窗的大小因动物种类不同而不同：犬10mm×15mm，家兔6mm×10mm，大鼠4mm×8mm)，用骨蜡及电热烧灼器止血，无菌生理盐水冲洗，待无出血点后，剪开硬脑膜，暴露软脑膜。窗口用制备成颅窗大小及形状的玻片覆盖，牙科水泥封闭周围间隙，待变硬后用手术刀将多余的部分切去。若颅窗周围无渗出、窗内无气泡与出血、脑血管无异常，表示颅窗制作成功。将实验动物置于微循环仪下，可观测到清晰的软脑膜微血管图像，通过摄像、录像或照片记录实验结果，亦可用计算机微循环图像处理系统，准确地测量微循环的各项指标。还可应用激光多普勒微循环血流分析仪，将激光探头固定于颅窗上，只要激光探头在整个实验过程中无位置移动及转动，即可准确的测定该部位的微循环血流量。

6.微透析结合液相色谱

微透析(microdialysis)是一种自生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。但由于微透析样品体积小，难以进行前处理浓集，而各种生化物质的含量又很低，因而给样品测定带来了困难。目前由于毛细管电泳仪技术的提高，能够检测采集的样品，使微透析技术日臻完善。应用微透析仪的方法为：在活体状态下，将动物置于立体定向仪上，在前囟右侧前、侧各1.5mm插入微透析探针，深度3.5mm(或感兴趣局域)。用灌流液灌流，速度2μl/min，基础灌流60min后收集微透析液。与液相色谱或毛细血管电泳仪连用，动态观测脑组织神经递质、神经内分泌激素等活性物质的动态变化。

7.电化学方法

可采用对pH、离子以及其他物质敏感的电化学电极，利用立体定位仪直接放置在感兴趣区域，动态观测上述各指标的变化。如采用一氧化氮敏感电极结合电化学检测技术，观察电针对MCAO大鼠缺血侧纹状体一氧化氮释放的影响等。

8.脑毛细血管通透性

大鼠按50mg/kg体重的剂量静脉注射1％伊文斯蓝，之后结扎大鼠双侧CCA。结扎后3h，断头取脑。将脑放入盛有5ml的甲酸胺溶液试管中浸泡，并置于45℃恒温箱中温

育72h。取出后用721分光光度计于620μm进行浸出液比色，测定光密度值。再以标准曲线查出5ml甲酸胺液中伊文斯蓝含量，继而计算出单位脑重的伊文斯蓝含量。以此评价毛细血管通透性。

9.血管活性物质及其他生物活性物质的测定

在脑缺血的情况下，线粒体氧化代谢障碍，不能提供足够的电子，且抗氧化系统被抑制，使含有不配对电子的自由基大量产生，超过机体的清除能力而造成损伤。因此测定脂质过氧化物(LOP)可以直接反映损伤的变化，测定氧自由基的清除剂超氧化物歧化酶(SOD)以及氧自由基攻击生物膜的多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物丙二醛(MDA)能间接反映出细胞的损伤程度。可以通过化学发光法、自氧化法、荧光法、TBA比色法等进行测定。

氧自由基在各种损伤、应激、感染中都可以出现变化，故缺乏检测的特异性和针对性，但它是机体反应的一种敏感指标，故可以作为急性期的辅助指标。

10.形态学指标法

(1)石蜡切片  HE染色观察：主要用于显示各种组织正常成分和病变的一般形态结构，进行的观察。普通的 HE染色光镜下就可以观测到梗死区间质内大小不等的空泡、血管扩张、脑组织水肿，部分神经细胞核固缩、深染，部分神经细胞溶解、胞浆疏松、细胞界限不清，坏死区周边可见嗜中性粒细胞。电镜分辨率比较高，可观察脑神经细胞缺血后的微血管状态、胶质细胞形态、神经细胞的形态、线粒体的变化等。还可以应用示踪技术进行定位。

(2)免疫组化法  应用标记的抗体对细胞或组织内相应的抗原进行定位、定性或定量检测。经组化显色后，用显微镜、荧光、电子显微镜观察。凡是能作为抗原、半抗原的物质如C-jun蛋白表达、cycline-D蛋白表达、MAP-2等脑缺血损伤相关蛋白均可以应用免疫组化准确定位。根据标记物的性质，可将免疫组化染色法分为：①免疫荧光法；②免疫酶法。③免疫金银法。④ABC法等。根据染色及抗体滴加步骤，分为直接法、间接法、桥法等。其结果除了在光镜下观察外，也可以输入医学图像分析系统进行图像处理，检测阳性细胞的平均灰度值。

免疫组化法在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其他生物技术难以达到和代替的。缺点是易于产生假阳性与假阴性，对于标本固定、选择、干燥、储存要求比较高。