局灶性脑缺血动物模型

局灶性脑缺血动物模型

大脑中动脉(Middle cerebral artery, MCA)是人类脑卒中的多发部位，大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，主要方法有线栓法、电凝法、光化学法和血栓栓塞法。

1 线栓法(thread occlusion of the middle cerebral artery)

(1)复制方法  雄性SD大鼠，体重为250～300g。经腹腔注射水合氯醛(350～400mg/kg体重的剂量)或戊丨巴丨比丨妥丨钠(50～60mg/kg体重的剂量)麻醉，仰卧位固定，剃除颈部毛发，手术区域皮肤常规消毒。切开右侧颈部皮肤，钝性分离胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌，显露右侧OCA及迷走神经。结扎 CCA、颈外动脉(exterial cerebral artery, ECA)及其分支动脉。分离右侧颈内动脉(interial cerebral artery, ICA)，至鼓泡处可见其颅外分支翼腭动脉，于根部结扎该分支。在ICA近端备线、远端放置动脉夹，在ECA结扎点(距颈内、颈外动脉分叉5mm处)剪一小口，将一直径为0.22～0.249mm(4-0号)的尼龙线经ECA上剪口插入。插入前加热处理使插入端变钝(也可在尼龙线头端用L-多聚赖氨酸涂抹后置肝素中浸泡，使成功率增高，梗塞面积恒定)，并做好进入线长度标记。扎紧备线，松开动脉夹，将尼龙线经ECA、ICA分叉处送入ICA，向前进入17～19mm时会有阻挡感，说明栓线已穿过MCA，到达大脑前动脉的起始部，堵塞MCA开口，造成脑组织局部缺血。1～3h后可缓慢退出尼龙线实施再灌注。

(2)模型特点  线栓法的优点为：无须开颅，动物损伤小，MCA闭塞效果较为理想，目前该模型被认为是惟一能观察到再灌流的局灶性脑缺血模型，近年来较为常用。注意点：线选择极为重要，较细时不容易穿到MCA，且缺血不明显；较粗时缺血重，容易造成实验动物的死亡。线要有的刚性，才能穿进ICA并穿进颅内，钢性过强则容易穿透动脉引起颅内出血。穿线位置也应当根据实验条件摸索。为提高线拴法大鼠局灶性脑缺血模型的成功率和稳定性，有学者研究了大鼠体重、拴线插入长度和直径与MCAO模型成功的关系，用正交试验法得出造模型的方案是采用大鼠体重为250～300g，线长为17m/n或18mm，线直径为0.28mm制作MCAO模型。成功率高、重复性较好。

2 电凝法(electric coagulate)

(1)复制方法  SD大鼠，雌雄不拘，体重为250～300g。经腹腔注射水合氯醛(350～400mg/kg体重的剂量)或戊丨巴丨比丨妥丨钠(50～60mg/kg体重的剂量)麻醉后右侧卧位，剃除颈部毛发，手术区域皮肤常规消毒。在左侧眼外眦到左外耳道连线的中点，垂直于连线切开皮肤约2cm。沿颧弓下缘依次切断咬肌和颞肌，将这些肌肉推向前上，操作时避免损伤面神经及动脉。用牙科钻在颧骨和磷状骨前联合前内2mm处钻孔开颅。在手术显微镜下切开硬脑膜，暴露并游离MCA。用双电极(电压12V)电灼损毁大脑动脉环起始至嗅沟段的MCA。为防止电极的电流对脑组织造成电损伤，在操作过程中不断向MCA周围滴加生理盐水并尽量减少电极在MCA上的作用时间。

(2)模型特点  开颅法的优点是实验条件较稳定，缺血效果可靠，是经典性缺血模型，在程度上模拟了人类一侧大脑半球缺血性梗死的情况。缺点是开颅法干扰了脑脊液动力学，易感染、创伤大，且闭塞后无法进行再灌注损伤。电凝并切断MCA起始部至大脑下静脉之间或嗅束内侧2mm至大脑下静脉之间的一段MCA后，可阻断豆纹动脉及近端小皮质支的侧支血流，在基底核区和皮质形成较恒定的梗死灶，梗死发生率可达100％。因此大鼠出现严重的神经功能缺失体征，且与梗死范围有显著相关性，从而为研究不可逆性脑缺血提供了可靠的动物模型。

3 光化学法(photochemistry)

光化学刺激可造成严重的血管内皮损伤，在短时间内光照区内的血管即可发生性血栓形成，进而形成局灶性的梗死灶。实验动物可选用兔、大鼠或豚鼠等造模。

(1)复制方法  动物麻醉后固定于脑立体定位仪上，剪除手术区域毛发，皮肤常规消毒。在左侧眼外眦到左外耳道连线的中点，垂直于连线切开皮肤约2cm，去处颞肌，显微手术镜下用钻头打开一直径6mm的骨窗，保留硬膜。将直径3mm的光导纤维远端置于颅底MCA经过嗅束的起始处，静脉注射化学荧光染料四碘四氯荧光素二钠，同时打开光源引导波长520～620mm的冷光照射。光线透过颅骨与血管内的染料接触，激发光化学反应，引起照射部位皮质血管内皮细胞毒性脑水肿，从而导致脑梗死。同时用多普勒激光探头监测脑组织血流量。

(2)模型特点  这一模型的优点为：①较好地模拟了人类脑血栓形成的动态过程，符合目前临床治疗理论的新发展，为临床治疗提供了有效的实验工具。②在硬脑膜外操作，不影响颅内压和颅内环境。③给药方式灵活且针对性强，既可预防性给药，观察药物提高血管抗损伤的效能，又可治疗性给药，评价抗血栓药、溶栓药和血管保护剂的药理作用和疗效。

Suzuki等用豚鼠光化学脑梗死模型观察到，这一模型在实施过程中存在反复缺血再灌注现象，表明这一模型在研究血栓形成缺血再灌注方面有独丨一丨无丨二的优势。不足之处为光敏物质对血液系统有影响，微血管明显损伤、血一脑屏障早期开放、血管源性脑水肿均为大血管闭塞的非典型表现，而非人类脑血栓形成的表现特征。

4 血栓法(autologous blood emboli)

(1)复制方法

1)血栓的制作  SD大鼠，经腹腔注射水合氯醛(350～400mg/kg体重的剂量)或戊丨巴丨比丨妥丨钠(50～60mg/kg体重的剂量)麻醉后使大鼠仰卧位固定于手术台上，剪除手术区域毛发，皮肤常规消毒。切开左下肢皮肤。找到股静脉，穿刺抽静脉血0.5ml加入0.15ml凝血酶(200U加0.4ml生理盐水)后立即混匀，随后注入2根连续硬膜外麻醉导管内，静置15～20min。缝合完皮肤后，将导管内的血凝块用注射器缓缓移入生理盐水中，清洗2～3遍以去掉血栓表面的红细胞。在显微镜下观察，选择富含纤维素的血栓剪成14～18个2mm长的小段，然后将这些被选择的片段置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液(或生理盐水)中。在磷酸盐缓冲液中静置4～5h，使其完成凝缩后，将血栓连同磷酸盐缓冲液一起吸入一根透明的连续硬膜外麻醉导管备用，注意避免导管内吸入空气。(也可在导管两端各接一装有生理盐水的注射器，使盐水反复通过导管冲洗血栓5min)。

2)鼠脑栓塞模型制作  待血栓凝缩4h后，将大鼠再次麻醉，手术区域皮肤消毒。颈正中偏左切开皮肤，钝性分离出左侧CCA，ICA和ECA。结扎ECA的2个分支，穿2根线于ECA，将ECA远心端结扎。结扎ICA分支翼突腭动脉。动脉夹夹闭CCA和ICA，在ECA远端剪一“V”形切口，将22号套管针由ECA远端向近端插管。插管成功后拔出针芯，将插入的套管置入CCA分叉处，用线固定套管，将含血栓的透明导管用20号套管针芯连接于22号套管，松开颈内动脉夹，缓缓将导管内的血栓和磷酸盐缓冲液注入ICA(30s)后拔出套管。结扎ECA近心端，松开颈总动脉夹，缝合皮肤。整个操作过程注意保持大鼠体温，肛温保持在36～37℃。

(2)模型特点  该模型产生了显著而持久的供血中断，并形成了范围恒定和边界清楚的梗死灶。在确定血栓注射入ICA后，造模成功率达80％以上。这种模型类似人类的自然梗死现象，手术创伤小，成功率高。血栓富含纤维蛋白，既适用于介入治疗和溶栓降纤治疗的研究，也适用于局灶性脑缺血药物保护机制的研究，以及血小板微血栓形成后的脑病理改变研究。该模型相对于线栓法和光化学法更贴近于临床上的脑栓塞。缺点是不易预见缺血部位和范围，不能再通，栓塞动脉对侧也可能受累，并可能导致外源性物质引起的炎症反应等。

5 局灶性脑缺血再灌注(reperfusion after local cerebral ischemia)

局灶性脑缺血再灌注选用多的模型是线栓法。按照上述方法阻断CCA，ECA和ICA，用栓线(尼龙线)阻断 MCA，造成脑组织局部缺血。1～3h后可缓慢退出尼龙线实施再灌注。

由于豚鼠光化学脑梗死模型的实施过程中存在反复缺血再灌注现象，因此这一模型可用于血栓形成缺血再灌注的研究。