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    血栓性疾病动物模型

    点击次数:683 发布时间:2018-09-13

    血栓性疾病动物模型

    正常情况下,机体内的血液在血循环内呈液体状态,是由于体内存在着相互拮抗的凝血和抗凝血系统。当机体受到某些物理和化学因素的作用,或本身有创伤和感染时,可引起机体免疫和代谢功能发生改变,造成体内凝血和抗凝血系统功能紊乱,终导致血栓形成。血栓形成主要涉及心血管内皮、血流状态和凝血反应三方面的改变,这三种条件通常合并存在,但常以某一条件为主。此外,当机体血液处于高凝状态时,如DIC、手术、创伤、妊娠等引起的血液凝固性增高也是血栓形成的原因之一。临床上血栓性疾病对患者危害,甚至可危及人的生命,所以加强血栓形成机制、血栓临床诊断、抗血栓药物方面的研究具有重要意义,这些研究均需要建立理想而实用的血栓动物模型。

    1 体外血栓模型

    (1)复制方法  取静脉血,注入体外旋转圆塑料环内,在体外血栓仪上以17.5r/min转动10min,然后取下塑料环,将血栓倒在滤纸上吸干水分,测量血栓长度、湿重及干重。

    (2)模型特点  模型制作方法操作简便,可直接观察血栓形成过程、测定纤维蛋白血栓形成时间和特异血栓形成时间。本模型适用于抗栓抗凝药物的药理研究,亦可作药物溶栓作用的研究。

    (3)比较医学  采用体外旋转圆环内模拟机体内的血流状态以形成血栓。当转环在沿垂直平面上顺时针方向旋转时,可在上下弯月面形成一个既有回流又有二次流的复杂流动区,为血小板聚集及血栓形成提供了有利条件。本模型形成的人工血栓同机体内自然形成的血栓在组织结构上相似。

    2 半体内血栓动物模型

    (1)复制方法  成年实验大鼠,按30mg/kg体重的剂量经腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将大鼠仰卧固定于手术台上,颈部皮肤常规消毒与去毛。无菌手术于颈部正中作一切口,钝性分离出左颈动脉及右颈外静脉,再取两根聚乙烯管,分别插入左颈动脉和右颈外静脉,然后套上另一内有丝线的聚乙烯套管,以便形成大鼠颈动静脉回路。术毕,立即拔下套管,取出丝线用滤纸吸干残血,精密称重。

    (2)模型特点  制作方法简单、经济,是目前国内常用的血栓动物模型。

    (3)比较医学  当模型大鼠颈动静脉回路建立后,其血流中的血小板接触旁路循环中的丝线粗糙面时,可发生黏附、聚集,血小板聚集物环绕丝线表面形成血栓。本方法形成的血栓结构类似于动脉中的白色血栓。用药物抑制此类血栓形成,除受血流速度和血液黏度因素影响外,主要与药物抑制血小板黏附和聚集功能有关。

    3 体内血栓动物模型

    1.物理刺激法

    (1)机械性损伤兔血栓模型

    ①复制方法  体重约为2.5kg的新西兰兔,按30mg/kg体重的剂量经耳缘静脉注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将兔仰卧固定于手术台上。用无菌手术分离其一侧股深动脉,选择直径为1mm的股深动脉血管段,用动脉夹夹住上下两端,中间留有1.5cm长的血管段为手术部位。在体视显微镜下,用7号针头从血管段上端沿血管向下刺入血管段内,并顺势注入生理盐水冲净血管内的血液,然后抽出针头,再用6号微型刮匙沿刺破孔进入血管,反复搔刮血管内膜。搔刮深度以0.5~0.7cm为宜,搔刮范围尽可能大些,以刮出少量血管内膜为宜。稍等片刻后,松开远端动脉夹,使血液充盈血管;待刺孔不渗血时,再取下血管两端血管夹,触摸家兔膝内侧皮下支动脉搏动示血管通畅后,常规手术逐层缝合,关闭皮肤切口。

    ②模型特点  术后24h模型动物即开始有血栓形成。模型制作方法简便,容易操作,重复性好,模型成功率高,但造模过程较费时。采用本方法也可制备静脉血栓模型。    ③比较医学  本模型造模机制同人类血栓形成极为相似,当刮匙搔刮损伤动物血管内膜后,可使血管内皮下细胞外基质(ECM)裸露,促使血小板与ECM(主要是胶原纤维)接触而被激活和黏附;同时裸露的胶原纤维激活因子及损伤的内皮细胞可释放出组织因子,进一步启动机体内源性和外源性凝血过程,导致血栓形成。本模型适用于动态观察血栓形成过程中血栓形态及血栓变化规律以及评价药物溶栓作用的实验研究,也适用于与形成和溶解血栓有关的其他实验研究。

    (2)电流刺激诱导大鼠血栓模型

    ①复制方法  成年实验大鼠,按30mg/kg体重的剂量经腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将大鼠仰卧固定于手术台上,颈部皮肤常规消毒与去毛。用无菌手术于颈部正中作一切口,钝性分离其右侧颈总动脉约15mm长;用两根直径为1.3mm,间距1.7mm的不锈钢棒作为刺激电极,将刺激电极和温度探子钩于动脉内膜上。采用刺激电流为1.5mA、刺激时间为7min。当血栓阻断动脉血流后,远心端动脉温度骤降,记录从电刺激开始到温度骤降所需时间,即为血栓形成时间。

    ②模型特点  本模型制作方法简单,容易操作。易受动物年龄、环境温度的影响,血栓形成时间不均一,实际应用时有局限性。造模过程中需遮盖手术切口附近的组织,以避免影响血管壁表面温度和刺激电极与周围组织接触。

    ③比较医学  通常认为,机体内动脉血栓产生的决定因素是血管内皮损伤及高切率血流(如狭窄),在高切率区血栓成分主要以血小板为主,而低切率区则以纤维蛋白和红细胞为主。而静脉血栓产生的决定因素则是内皮损伤,血液淤积呈高凝状态,其血栓主要成分是纤维蛋白、红细胞、少量的血小板及白细胞。本模型造模机制为当直流电刺激颈动脉壁时可造成血管损伤,使血管内膜变得粗糙不平,引起血小板黏附、聚集,并释放一系列活性物质,激活机体内源性凝血系统;同时受损血管内膜释放的组织凝血活素又可激活机体外源性凝血系统,导致动脉管腔内逐渐形成肉眼可见的混合血栓。本模型形成的血栓成分在电刺激区主要以血小板及纤维蛋白为主,并可见少量红细胞及白细胞;而在电刺激远端则以纤维蛋白及红细胞为主。采用本方法复制的大鼠动脉血栓与人类动脉血栓在组织形态结构上相似,适用于作抗血栓形成药物筛选方面的研究。

    (3)光化学诱导大鼠血栓模型

    ①复制方法  成年实验大鼠,按30mg/kg体重的剂量经腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将大鼠侧卧固定于手术台上,头部皮肤常规消毒与去毛。用无菌手术经左侧颞部入路,于左眼外眦和左耳外耳道连线上近眼外眦1/3处作一垂直长约2cm的弧形切口,分离颞肌并去除颧弓,用拉钩拉开下颌关节,在卵圆孔前上方用牙科钻钻一直径为5mm的骨窗,切开硬脑膜即可见大脑中动脉(MCA),选择MCA的近端(起始部)和从嗅束至大脑下静脉间的一段MCA为光照部位,将自制LG-150B冷光源的光纤端口置于距MCA表面约5mm处,将光纤所射出的光束垂直对准MCA。先将光纤移至MCA起始部,经股静脉注入1.5%虎红B(四碘四氯荧光素钠)5min后,注射剂量为2ml/kg体重,再持续光照10min;然后将光纤移到嗅束至大脑下静脉段MCA表面,再注入半量虎红B,仍持续照射10min,即可制备成功血栓模型。

    ②模型特点  模型制作过程中采用分离颞肌、拉开下颌关节的方法,既可保留术后模型大鼠的咀嚼功能,又能提高模型动物的存活率。同时采用分步照射法,并在两次注射光敏剂时剂量减半,可避免动物损伤程度过重,从而制备出较为实用可靠的大脑中动脉血栓模型。本方法制备的血栓模型稳定,结果可靠,成功率高。

    ③比较医学  本模型的造模机制是由于虎红B在单色绿光下可产生并释放单态氧,导致血管内皮细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,造成细胞膜的通透性发生改变,Ca2+内流增加;同时脂质过氧化物增加又可破坏机体内前列环素(PGI2)与血栓素B2(TXB2)的平衡,促进血管内的血小板聚集与黏附,激活凝血过程,形成血栓并进一步阻塞血管导致缺血;在凝血过程中可产生大量血管活性物质及神经毒性物质,这些物质可破坏脑细胞尤其是血一脑脊液屏障,致病机制与人类脑梗死发生极为相似。本模型的血栓形成过程与临床上人类脑血栓形成在发病机制、血栓形成过程、损害程度方面较为相近,造模方法对模型动物血管本身无机械性损害,可应用于临床上脑血管病的发病机制、药物筛选及康复医学的实验研究。

    2.化学药物诱导法

    (1)胰蛋白酶血栓形成法

    ①复制方法  体重约为2.5kg的新西兰兔,按30mg/kg体重的剂量经耳缘静脉注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将兔仰卧固定于手术台上。颈部皮肤常规消毒与去毛。用无菌手术于颈部正中作一切口,钝性分离暴露右侧颈总动脉约2.5cm,用显微外科动脉夹夹住颈总动脉近心端和远心端,两端分别插入8号针头,在针头进入部位结扎血管,两端结扎线相距1.5cm;经近心端针头用输液泵匀速(0.6ml/min)灌注1.0%胰蛋白酶15min。然后以相同速度灌注生理盐水冲洗并经远心端排出,后拔出针头用无创伤性针线缝合针孔。手术闭,放开动脉夹使血流复通。

    ②模型特点  模型制作方法简便、可靠,重复性好。

    ③比较医学  模型造模机制:由于胰蛋白酶具有蛋白水解作用,其进入模型动物机体后可使血管内膜和部分肌层脱落,造成血小板黏附、聚集,终导致血栓形成。本模型所形成的血栓组织形态结构富含血小板和纤维蛋白,与临床上动脉血栓形成相似,可用于抗血栓药物疗效观察和筛选方面的研究。

    (2)过氧化氢(H2O2)血栓形成法

    ①复制方法  体重约为2.5kg的新西兰兔,按30mg/kg体重的剂量经耳缘静脉注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将兔仰卧固定于手术台上。颈部皮肤常规消毒与去毛。用无菌手术于颈部正中作一切口,钝性分离暴露其一侧颈总动脉,用两个显微外科动脉夹夹闭颈总动脉,夹间距离约为2.5cm,用4号针头刺入动脉并结扎固定,用针筒迅速抽出动脉夹之间动脉内的残留血液,并用生理盐水反复冲洗3~4次,直至动脉段内无残血。然后用10%过氧化氢(H2O2)溶液0.4ml分4~5次注入动脉段内连续作用10min,再用生理盐水冲洗2~3次后,用黏合胶黏合针孔,放开动脉夹恢复血流。

    ②模型特点  模型制作方法简单、效果可靠,形成的血栓主要为白色血栓,符合临床动脉血栓的特征。

    ③比较医学  模型造模机制:过氧化氢进入机体血管后可损伤血管内膜,并引起血小板黏附、聚集,终导致血栓形成。本模型适用于探索预防血栓形成方法方面的研究。

    (3)三氯化铁(FeCl3)血栓形成法

    ①复制方法  成年实验大鼠,按30mg/kg体重的剂量经腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将大鼠侧卧固定于手术台上,头部皮肤常规消毒与去毛。用无菌手术自眼眦和外耳道中线处剪一切口,除去颧弓,暴露颞前窝及鳞状骨大部分,随后在颧弓和鳞状骨前联合的前下方约2mm处用牙科钻一直径约2mm的小颅窗,暴露大脑中动脉(MCA),用一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50%三氯化铁(FeCl3)溶液10μl的小片滤纸敷在暴露的大脑中动脉上20min,共敷两次后去掉滤纸。再用生理盐水冲洗局部组织,常规手术逐层缝合。

    ②模型特点  模型动物形成的动脉血栓为混合血栓,主要成分为血小板、红细胞及纤维蛋白等。模型制作方法简单、可靠,重复性好,但由于造模时需去除颧弓,影响动物进食,不利于作长期观察。

    ③比较医学  本模型利用铁离子进入机体血管后,可作用于血管壁造成血管内膜损伤,血小板黏附、聚集,终形成血栓的原理建立。模型制作过程中仍保留有大脑中动脉,可进行血管动态观察,比较接近于临床患者的实际情况,本模型适用于抗栓药物和溶栓药物的筛选及疗效观察,还适用于TTC染色技术直观地观察脑梗死程度。

    3.血栓诱导法

    (1)复制方法  成年雄性KM小鼠或SD大鼠,将角叉菜胶用生理盐水配制成0.1%和1%溶液后,经小鼠腰背部和大鼠后肢足跖部皮下注射。注射3~14h后,大多数模型动物的尾尖部可出现暗红色血栓形成区,并逐渐向尾根部扩大;注射48~72h后局部可从发绀变为黑色,随后尾部干细断落。

    (2)模型特点  注射24h后,模型动物尾部小静脉和毛细血管内含有大量纤维素,以及少量白细胞及血小板,血管内皮细胞核浓缩呈骰子状,血管内壁中性粒细胞靠边;72h时可见较大血管呈炎症改变并伴有混合性血栓形成。由于血栓发生在尾部且界限明显,可从体表直接观察血栓形成出现的时间与发展过程,并能测量血栓形成波及的范围或长度,可为研究体内血栓形成全过程提供一个简便、直观的动物模型。模型制作方法简单,结果可靠,重复性好。

    (3)比较医学  模型制作使用的角叉菜胶是从海藻中提取的含硫酸多糖物质,也是一种较强的致炎物质,其诱发的动物尾动脉局部血栓与血管内炎症密切相关。由于炎症时可释放大量炎症介质如白细胞介素-1、肿瘤坏死因子等,它们可破坏正常血管内皮细胞维持凝血与纤溶之间的平衡作用,从而促发动物血栓形成。同时血管内皮细胞损伤时可造成某些舒血管物质如乙酰胆碱等分泌减少,缩血管物质如内皮素等增多,引起局部血管痉挛,从而加重局部血管的缺血缺氧状况,进一步促进血栓形成及血管内皮损伤。本模型适用于临床上抗血栓药物疗效观察和筛选方面的研究。

    4.手术法

    (1)犬股动脉异物法血栓模型

    ①复制方法  体重约为10kg的雄性实验犬,按30mg/kg体重的剂量经静脉注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将犬仰卧固定于手术台上。用无菌手术分离其一侧股动脉约7cm,在其两端用显微外科动脉夹夹闭,夹间距离约为3.5cm,沿股动脉远心端向近心端方向在夹闭段股动脉内安插直径为0.5cm、长度为1.5cm的单股螺旋钢丝,进入血管内腔后结扎固定,行血管缝合术,再用医用生物黏合胶黏合。放开动脉夹,恢复血流畅通,确定手术视野无渗血后,常规手术逐层缝合。

    ②模型特点  制作方法简单易行,可靠性强,重复性好。

    ③比较医学  在模型动物股动脉内放置螺旋钢丝线圈,可造成动脉内膜损伤,造成局部血流动力学改变,进一步激活机体凝血系统,促进血小板凝集并释放一系列活性物质,终导致血栓形成。本模型形成的血栓主要由血小板、白细胞及纤维蛋白构成,目前多用于血栓放射免疫显像方面的研究。

    (2)大鼠结扎法

    ①复制方法  成年实验大鼠,按30mg/kg体重的剂量经腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨钠麻醉,麻醉后将大鼠侧卧固定于手术台上,腹部皮肤常规消毒与去毛。无菌手术开腹,分离其下腔静脉,于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉,然后缝合腹壁;结扎2~6h后重新打开腹腔,在结扎线下方2cm处用血管夹夹闭血管,剖开管腔并取出血栓,于60℃烘干后称量血栓质量,以血栓质量或血栓形成百分率作为评价指标。

    ②模型特点  采用本方法通常在结扎后2h,模型动物血栓形成率可达到60%~80%,此时处死动物主要观察血栓形成百分率;结扎6h后模型动物血栓形成率为100%,此时主要观察血栓质量。模型制作方法简单易行,重复性好,效果可靠,成功率高。

    ③比较医学  用粗丝线结扎大鼠下腔静脉,可引起局部血流淤滞、缺氧,造成血管内皮细胞损伤,从而启动内源性凝血系统;同时,血管内黏聚的血小板与局部形成的凝血因子因血流受阻滞留在局部,终导致血栓形成。本模型多用于溶栓药物体内抗血栓作用的评价。

    目前,随着临床上血栓性疾病的发病率逐年增高,如何开展有效的诊断、预防和治疗,已引起国内外临床医学界的广泛关注。建立各种血栓性疾病动物模型用于实验研究已成为重要手段,迄今为止已形成了许多动物血栓模型的建立方法。由于各种血栓模型均有各自的特点,因此应根据研究目的和需要来选择合理的血栓动物模型制作方法,如机械损伤法、股动脉异物法、电流损伤法、胰蛋白酶血栓形成法、过氧化氢法、角叉菜胶血栓形成法等适用于作动脉血栓的研究;机械损伤法、结扎法则适用于作静脉血栓的研究;而脑栓塞的研究则可选择三氯化铁血栓形成法和光化学法,以免事倍功半。

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