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    血小板疾病动物模型

    点击次数:926 发布时间:2018-08-31

    血小板疾病动物模型

    小鼠血小板减少性紫癜模型

    (1)复制方法  体重约为20g,年龄为8周龄的BALB/c小鼠。抗原制备:BALB/c小鼠经乙丨醚麻醉后,眼球摘除取血(EDTA-Na2抗凝),分离血小板并洗涤,用生理盐水稀释。免疫:取已准备好的血小板分别与等量弗氏佐剂和不弗氏佐剂混合成油包水状作为抗原。取含有弗氏佐剂的抗原于0周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下,每次至少4点,第5周豚鼠心脏取血(不抗凝)。560r/min,离心10min,取上清,得到豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS),-20℃保存。抗血清处理:将APS从冰箱取出,56℃水浴30min,用等量BALB/c小鼠红细胞吸附至少2次,用生理盐水稀释成不同浓度APS备用。采用ELISA或者琼脂扩散法检测抗血清的效价。于BALB/c小鼠腹腔内注射抗血清(100μl),造成小鼠一过性血小板减少。于注射抗血清后第1, 3, 5, 7, 9, 11, 13日分别经小鼠腹腔注射已制备好的豚鼠抗小鼠血小板血清,每次100μl,使小鼠慢性持续血小板减少。于预定时间麻醉处死小鼠,取其脾脏、胸腺,肾上腺、股骨标本经固定液固定后,作常规组织切片,显微镜下观察。

    (2)模型特点  注射抗血清后模型小鼠可出现竖毛、便溏、体重减轻、精神萎靡、食耗量及饮水量均减少等症状。造模后24h起模型小鼠开始出现死亡,死亡小鼠可见其腹腔、肠道、尿道出血,后腹膜有大量出血点;造模后1~3d为小鼠死亡高峰时间。动物死亡及各种出血表现多见于注射抗血清后7d之内。抗血小板血清注入模型小鼠体内后,可引起血小板计数显著减少。血小板相关抗体(PAIgG)升高。注射后6h小鼠脾脏重量开始增加,至第5日时脾重可为正常小鼠的3.6倍。注射抗血清后第6日脾脏巨核细胞开始明显增多,至第15日时仍维持高水平,此后趋于正常;脾脏重量增加与巨核细胞增加明显一致。镜下病理组织学观察显示:造模后6h骨髓组织内即可见巨核细胞增多,至第3日时达到高峰,直至22d仍高于正常小鼠。有1/4的模型小鼠可见胸腺、肾上腺皮质萎缩。造模后小鼠出现明显皮下紫癜,以注射部位(腹部)、阴丨囊、四肢、尾部为重。采用本方法(免疫法)建立的小鼠(或兔)的血小板减少性紫癜模型,制作原理简单,操作方法较为复杂,干扰因素小,成本相对低廉。但其抗体为外源性的,需不断补充输注,维持慢性ITP稳定性相对要差。效果优于以往用ADP、马利兰、环磷酰胺或放射线照射等方法复制的血小板减少动物模型。虽然用ADP、马利兰、环磷酰胺等方法建立的模型也可引起血小板减少,但由于这些复制方法是通过损伤模型动物的骨髓造血干细胞,从而造成骨髓和外周血三系细胞均减少来复制血小板减少模型,其发病机制和临床表现与ITP并不相同,在研究治疗ITP新药的药效或药理学实验中,可直接影响对疗效的判定。应用本方法复制ITP动物模型的关键在于血小板抗原的纯化,免疫途径及方法可直接影响APS的效价。

    (3)比较医学  原发性血小板减少性紫癜是临床上常见的出血性疾病,以机体外周血小板减少,骨髓巨核细胞增生伴成熟障碍为主要特征。由于从临床患者的血液中可检测出抗血小板抗体,因此又称免疫性血小板减少性紫癜。其发病机制是由于同种抗体或自身抗体与血小板膜抗原结合,引起血小板破坏增多而发病。因此,血小板抗体的检测在 ITP疾病的诊断和疗效判定方面非常重要,本病的临床治疗以使用皮质激素、免疫抑制剂和脾切除为主,从远期疗效看,大多数患者还不能获得缓解。所以在基础和临床研究上都急需有突破性进展,目前临床上主要是侧重PAIgG的研究。采用注射外源性抗体建立的慢性ITP动物模型,与临床上人类ITP的患者表现出相似的特征。当抗血小板血清注入模型动物体内后,引起血小板计数显著减少,PAIgG水平升高;注入的抗血清越多,PAIgG升高也越多,血小板减少程度越严重。同时模型动物的血小板寿命缩短,并伴有发热、紫癜及止血障碍等。本模型对于人类ITP发病机制研究、抗血小板减少药物的筛选有较大应用价值。

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