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    白细胞疾病动物模型

    点击次数:811 发布时间:2018-08-31

    1 白细胞减少症动物模型(Animal model of leucopenia)

    在研究化疗药物毒性的减毒实验中,经常需要建立化疗所致的白细胞减少症及骨髓有核细胞减少症的动物模型。白细胞减少症(leucopenia)为临床常见血液病。凡机体外周血液中白细胞数持续低于4×1000000000/L时,称之为白细胞减少症;若机体白细胞总数明显减少,低于2×1000000000/L,中性粒细胞值低于0.5×1000000000/L甚至消失者,则称为粒细胞缺乏症(agranulocysis)。临床上白细胞减少症患者的临床表现主要为乏力、头晕,并常伴有食欲减退、四肢酸软、失眠多梦、低热心悸、畏寒腰酸等症状;而粒细胞缺乏症则多以突然发病、畏寒高热、咽痛为主。粒细胞缺乏症为白细胞减少症发展至严重阶段的表现,两者病因和发病机制基本相同。临床上白细胞减少症主要可分为原因不明性和继发性两种。其中又以前者多见,而后者则多为化学因素、物理因素、药物因素及某些疾病;或可见于各种实体肿瘤化疗后、多种血液疾病、严重感染及原因不明者等。

    1.1 大鼠白细胞减少症模型

    (1)复制方法  体重约为150g的SD大鼠,按30mg/kg体重的剂量经其腹腔注射环磷酰胺,连续注射5d。模型大鼠在给药前、给药第3, 5日,以及停药后第2, 5, 8, 11, 15日时分别采血作外周血象检测,观察外周血白细胞总数。后1次检测观察后麻醉处死动物,取其股骨,用hanks液冲洗骨髓细胞,显微镜下观察骨髓有核细胞数。

    (2)模型特点  注射环磷酰胺后,模型大鼠的食耗量、饮水量减少,活动减少,被毛疏松无光泽,体重增长趋缓,明显消瘦;停药15d后机体开始明显恢复。给药3d时,模型大鼠的外周血白细胞总数明显降低,给药5d时其外周血白细胞总数可降至低值;停药后第2日时白细胞总数无明显回升,停药第5, 8, 11, 15日时,白细胞总数呈逐渐回升趋势;模型大鼠低白细胞水平维持时间较长,至停药后第15日时仍未见明显回升。镜下观察显示:模型大鼠的骨髓有核细胞数较正常动物明显降低。

    (3)比较医学  本模型通过对动物机体白细胞总数、体重变化以及骨髓有核细胞数检测结果的多点动态分析,模型大鼠表现出低白细胞、低骨髓有核细胞及低体重的特点,与临床上肿瘤患者的化疗毒性一致,本模型可用于临床化疗毒性的防治、药物筛选或其他防治方法方面的研究。以往这方面的研究均用小鼠建立模型,但由于小鼠外周血白细胞第6日以后即可超越基础水平,往往造成实验观察时间不够,导致无法评价实验结果。而本方法建立的模型,停药后模型大鼠白细胞回升缓慢,至停药后第15日时仍能维持低白细胞水平状态,因此能够满足实验研究的观察时间。

    1.2 急性白血病动物模型(Animal model of acute myelogenous leukemia)

    临床上急性白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是指机体内一种或多种造血干细胞及祖细胞恶变,失去正常的增殖、分化及成熟能力,无控制的持续增殖,逐步取代骨髓并经丨血液浸润至全身组织及器官。

    1.小鼠粒单白血病模型

    (1)复制方法  体重约为20g,年龄为8周龄的 BALB/c雄性小鼠。用1000r/min离心急性粒单白血病细胞的培养液10min,去上清后用生理盐水清洗3次,调整浓度至2×1000000000/L。经小鼠尾静脉注射已制备好的细胞悬液,0.5ml/只。接种后每天观测模型小鼠的生存天数,采血作小鼠外周血白细胞计数、未成熟粒单核细胞百分率及骨髓原始粒单核细胞百分率检测,透射电镜下观察其骨髓白血病细胞形态。

    (2)模型特点  采用尾静脉途径接种的方法,模型小鼠的生存时间可达到(38.40±2.21)d;其外周血白细胞计数和未成熟粒单核细胞百分率在接种第14日时明显升高,分别为(19.24±1.73)×1000000000/L和(6.24±0.85)%,并有逐渐上升的趋势;其骨髓原始粒单核细胞百分率亦明显升高,可达到(41.3±4.90)%。本模型制作方法简便,容易掌握,模型成功率高,重复性好。实验过程中,模型小鼠由于免疫力低下,因此需加强对动物实验及饲养管理条件的控制。

    (3)比较医学  临床上急性粒单白血病以骨髓或外周血中同时出现原始髓系细胞分化而来的原幼粒系和单核系两种幼稚细胞为主要特征。本模型的病理特点与临床人类急性粒单白血病相似,适用于临床同类疾病发病机理及药物治疗方面的研究。

    1.3 慢性白血病动物模型(Animal model of chronic myelogenous leukemia)

    临床上慢性白血病(chronic myelogenous leukemia,  CML)可分为慢性骨髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病两种。慢性骨髓细胞性白血病,简称慢粒(chronic myelognous leukemia, CML),是临床上一种起病及发展相对缓慢的白血病。它是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病,表现为髓系祖细胞池扩展,髓细胞系及其祖细胞过度生长。CML临床上以乏力、消瘦、发热、脾肿大及白细胞异常增高为主要表现。慢性淋巴细胞白血病,简称慢淋(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL),是机体的淋巴细胞在体内异常增生和积蓄伴有免疫功能低下的疾病。由于慢淋患者淋巴细胞寿命极长,并经常伴有免疫反应缺陷,故又称免疫无能淋巴细胞蓄积病。临床主要表现是以淋巴结肿大为主,常伴有肝脾肿大,贫血及出血等症状,少数患者还伴有皮肤损害。

    1.免疫缺陷小鼠-人慢性粒白血病模型

    (1)复制方法  NOD/SCID小鼠,系通过SCID小鼠与 NOD/Lt品系(TL、BL、NK细胞缺陷,循环补体缺乏,抗原呈递细胞分化及功能不良)回交得到的NOD/Ltsz-scid/scid小鼠(简称NOD-SCID小鼠)。先用400cGy 60Coγ射线照射小鼠,再从未接受过化疗的慢性期CML患者的新鲜骨髓和外周血中分离出白血病细胞,将(8~14)×10000000白血病细胞从尾静脉输入已经过亚致死量射线照射的小鼠,并交替腹腔注射PIXY321(7μg)及c-kit配体(10μg)制剂。CML细胞移植后30~90d内处死小鼠,用人bcr特异DNA探针进行 Southern印迹分析和流式细胞仪检测。

    (2)模型特点  移植后的NOD/SCID小鼠体内大约70%的人CML细胞为Ph-细胞。无论是用CML患者的骨髓细胞还是外周血细胞移植,ph+细胞检测水平很相似。用本方法复制CML模型,NOD/SCID小鼠效果要优于SCID小鼠。由于NOD/SCID小鼠体内缺乏功能性NK细胞,采用较少数量的患者CML慢性期细胞就能成功建立模型。如将人造血干细胞或胎肝细胞移植到NOD/SCID小鼠体内,则人髓系白细胞数明显增加,人造血干细胞明显向髓系方向分化,而红系细胞和淋巴系细胞明显减少;此时如采用患者 CML细胞,尤其是加速期和急变期细胞更容易移植成功。

    (3)比较医学  以往研究发现来源于CML患者急变期的瘤细胞能够在SCD小鼠身上繁殖,白血病细胞在转移到无造血功能组织之前主要分布在骨髓、外周血,与其在人体内的分布极其相似。但由于小鼠的造血生长因子、黏附分子和细胞外基质与人并不相同,因此建立的免疫缺陷小鼠-人慢粒白血病模型仍存在局限性。但是采用NOD/ SCD小鼠仍可用于制备较为理想的人CML动物模型。

    2.用表达P210逆转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞并移植正常鼠

    (1)复制方法  分离用氟尿嘧啶(5-Fu)(150mg/kg体重)预处理的雄性BALB/c小鼠骨髓细胞,并以P210基因逆病毒载体转染,按(1~2)×100000细胞注射到接受致死剂量照射的同源雌性小鼠体内。潜伏期大于20周的小鼠表现出粒细胞异常增生,造血功能紊乱,从这些小鼠身上分离的细胞,可有效地移植到经照射的同源小鼠体内,表明转染bcr/abl基因的鼠骨髓细胞具有高度再生能力,可用来模拟人CML。采用MSC逆转录病毒载体,可提高表达ber/abl融合基因的病毒滴度,CML潜伏期短,接受转染细胞的小鼠经过4~6周潜伏期后都可发生CML。主要变化有外周血白细胞显著增多,脾脏肿大,bcr/abl融合蛋白大量表达。

    (2)模型特点  发现无论abl基因的形式如何,均有90%小鼠发生肿瘤。在这些小鼠中有大约50%小鼠表现异常骨髓增殖,与人慢性粒细胞白血病慢性期的特征有许多相似之处,而其余的小鼠则表现为B淋巴细胞异常增生。

    (3)比较医学  采用本方法建立的CML动物模型与临床上人类CML尚有一些差异,如大多数CML模型鼠往往在短期内迅速死亡,没有经历类似于人CML的慢性期,而且模型动物肺部出血现象很明显,这在人类CML很少见。

    3.bcr/abl转基因小鼠模型

    (1)复制方法  用小鼠的Tec基因的启动子序列(-1948至+22)作为调节序列,制备转基因载体。Tec基因的启动子序列调控P210蛋白的表达,制备转基因小鼠, bcr/abl融合蛋白的表达对小鼠的胚胎有致死性。

    (2)模型特点  目前仍不能获得的转基因小鼠及其子代均表现CML症状,一些个体可能表现出急性白血病症状。

    (3)比较医学  多数转基因小鼠先出现粒细胞异常增生、高血小板血症,经时间后发生骨髓增殖综合征(MPD),和人CML极为相似。少数转基因小鼠在出生后即表现为急性白血病,但它们的子代经过一段潜伏期后表现为骨髓增生综合征。表明选择恰当的启动子对构建CML转基因鼠是十分重要的。

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