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    骨关节炎动物模型

    点击次数:979 发布时间:2018-05-25

    骨关节炎(osteoarthritis, OA)是中老年人常见的一种慢性进行性疾病。是由于关节软骨退行性改变(退变)和关节表面边缘形成新骨的退行性病变,其病因、分子生物学、早期诊断和治疗均存在问题,需要进一步研究。骨关节炎动物模型无疑是研究人类骨关节炎病理机制和防治方法的良好工具。骨关节炎动物模型有的是自发的,也可通过关节制动、手术改变关节应力、破坏关节血液循环、关节内药物注射、关节内植入软骨碎片等方法建立。

    1 自发性动物模型

    (1)C57BL小鼠  自从20世纪40年代Silberberg先发现C57BL小鼠具有骨关节炎特征以来,有研究报道已经对C57BL小鼠的这种特征进行了动态病理组织学研究。该小鼠3个月龄时关节软骨基质中糖胺聚糖染色性降低;6个月龄时60%小鼠关节软骨可出现Ⅰ度骨关节炎改变,主要表现为半月板游离缘附近的关节软骨表面不平整,排列在表层的扁平软骨细胞脱落、消失,软骨下骨小梁密度改变;18个月龄时小鼠均可出现Ⅰ度以上的骨关节炎改变,其中18%的小鼠出现Ⅱ度骨关节炎改变,9%出现Ⅲ度骨关节炎改变。该自发性模型与人类骨关节炎的差异主要表现为,其没有关节软骨的微纤维化,关节软骨剥离脱落呈腐蚀状,软骨细胞无集簇及骨刺形成,滑膜炎症不明显;骨关节炎进程中不伴有糖胺聚糖和DNA合成增加。表明该小鼠软骨的自我修复功能缺乏或受到抑制。已有研究证实,给 C57BL小鼠饲喂高脂饲料,可加速其关节的退行性病变。

    (2)豚鼠  已往研究报道证实,12月龄后的豚鼠在股骨内侧髁中央可出现与人类骨关节炎相似的病理变化,且病理变化随年龄增长而逐渐加重;而外侧髁无明显变化。豚鼠骨关节炎病程发展过程缓慢,与临床上人类骨关节炎极为相似,且其软骨基质病变程度与负荷呈正相关。

    2 诱发性动物模型

    2.1 机械制动模型

    当模型动物的下肢关节机械制动一段时间后,局部不论是否施以外加压力,关节软骨均可出现与临床相似的退行性改变,且不论采用伸直位、屈曲位或中间位。研究发现家兔膝关节制动60d后,由制动所造成的大部分关切软骨的变化无法逆转。若制动不超过30d,电镜下关节表面的圆形突起未破坏,切线层纤维束未暴露,病变则有恢复的可能。若制动时间超过30d,则可导致关节的进行性破坏。若以屈曲位制动,则因减少了横跨膝关节的肌肉的收缩,可导致关节骨的萎缩性变化;若以伸直位制动,则限制了关节的运动、肌肉、关节囊收缩,对关节面产生了过度压力,可导致0A的发生。实验研究进一步表明,短于4d的关节制动,即具有的病理积累作用,无论是短期的反复制动或是持续制动。 Okazaki等实验研究也表明,家兔膝关节伸直位制动7~14d后,关节软骨即出现早期退变,28d后出现关节软骨中度退变,42d后则出现严重的退变,并发现P53mRNA在此过程中发挥了重要作用。故有人认为将兔膝关节于伸直位制动5~6周,即可得到0A动物模型。

    2.2 手术方法制作骨关节炎模型

    (1)复制方法  取膝内侧切口切除家兔髌下脂肪垫后,沿髌骨内外缘切除关节囊及滑膜各一条组织(10mm×5mm),然后作鼠蹊切口游离髂外和骨静脉,结扎并切除1.5cm的血管,术后家兔自由活动。

    (2)模型特点  术后30d,光镜见髌骨表面近远两端有丘状新生骨形成,并伸入腱附着区内,为编织状骨;髌骨关节中,髌软骨的软骨细胞层次清楚、完整,但髌骨近远端处软骨变薄,层次紊乱,有的部位只见纤维组织覆盖于松质骨表面;术后60d,髌骨表面新生骨渐趋成熟;术后90d,新生骨表面发育为正常骨皮质,其下面出现骨髓腔,新生骨下原髌骨皮质内髓腔化明显。术后60d,股四头肌腱和髌腱内出现肥大、核圆的软骨细胞,基质无钙化,90d时形成片状软骨灶。

    (3)比较医学  骨关节炎的发生机制复杂,一般认为是多因素综合所致。继发性骨关节炎中,关节应力的改变及关节局部血供的异常是重要原因。因此,运用使关节失稳或改变应力或减少关节血供造成静脉回流不畅,均可造成与临床相似骨关节炎模型。但不同种动物及不同方法造成的骨关节炎模型,其病理表现不尽一致。如鼠的关节几何形状与人类并不相同,此外小鼠软骨中不含硫酸角质素,而人类关节软骨内此物质随年龄增加而增多;如以大鼠或小鼠等啮齿类动物作为模型,则分析实验结果时应考虑上述差异。研究骨关节炎的病理进程、组织病理特征或软骨生化代谢的变化,通常情况下可选用犬或兔作为模型动物。

    常用骨关节炎动物模型手术方法分类:

    1)破坏关节稳定性  破坏关节稳定性是目前国外常采用的一种OA造模方法。关节稳定性是保持关节正常结构和功能的一个重要因素。若关节不稳,必使关节各结构的动态平衡失调,从而使关节发生退行性改变。常用的造成关节不稳的手术方法主要包括:切断内侧副韧带、切断前、后交叉韧带,切除内侧半月板及切除髁、膑骨等。McDevitt等切除犬、兔前交叉或前后交叉韧带、切断家兔前交叉韧带和内侧半月板造成关节失稳,手术后见关节滑膜增厚,软骨表面糜烂,细胞成簇排列,骨赘形成,关节软骨中黏蛋白减少,酸性磷酸酶增加,蛋白、糖胺聚糖(GAG)合成率增加,胶原纤维成分无变化,软骨细胞合成的黏蛋白中含有更多的硫酸软骨素。切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部,并在断端处修剪去除约2mm,造成小鼠双后肢外翻畸形,术后2d放于拖箱内,每天赶其行走30m,2周后,光镜见软骨厚度变薄,电镜软骨细胞有明显的外形改变,表明软骨细胞处失代偿期;造模4周,软骨厚度显著变薄,电镜见软骨细胞变形严重呈不规则状,胞质内充满脂滴、糖原颗粒及微丝,细胞器外形模糊,细胞核深度凹陷变形,细胞旁出现嗜锇性脂肪碎屑,基质内胶原纤维显露明显且较正常为粗,结构松散紊乱;手术8周,病变与人4周相似,但程度加重。路氏等将切除韧带与半月板结合,成功地诱发膝关节骨关节炎,且认为该模型制作期限合理,病灶典型。术后3周就出现了骨关节炎的早期改变,包括软骨细胞排列紊乱,表层轻度糜烂,可见散在的软骨细胞簇及局部溃疡。术后6周出现了明显的骨关节炎症改变,6周X线显示了关节间隙异常及胫骨上端变形。从而表明关节的不稳定是造成关节软骨破坏,形成骨关节炎的原因。将鼠或兔内侧半月板切除30%~50%,同时,让其自由活动,成功地复制出OA模型,且认为这种造模方法对研究OA关节软骨细胞凋亡是一种很好的动物模型。而 Mansour等采用半月板部分切除和交叉韧带切除术后造成动物OA模型进行研究发现,改变兔膝关节动力装置在实验动物OA产生过程中并不是起关键的作用。

    2)降低关节应力  研究表明在OA的发生机制中,缺乏负重可能是重要环节之一。由低应力导致的软骨退变早期,软骨细胞缺乏骨退变中常见的代偿性增生表现,说明低应力可能对软骨退变修复有抑制作用。国内顾氏等将大鼠一侧后肢跟腱切除约2mm,术后允许动物自由活动,术后1周至1个月,软骨未见异常改变;术后2个月,部分软骨出现裂隙,多集中于软骨的浅表,正常软骨细胞柱存在,有少量固缩的软骨细胞;术后3个月软骨裂隙增多,有些可深达钙化层,部分区域有软骨小片缺损,软骨细胞排列紊乱,较多软骨细胞发生退变,并有空陷窝出现,某些区域有软骨细胞族出现;术后5~8个月,上述改变程度更明显,软骨细胞柱正常形态消失。

    3)增加骨内压  自1983年Larsen次提出骨内压概念后,国外对骨内压与OA的关系有了较详尽的研究,提出导致骨内压上升的主要原因是由各种因素引起的骨内静脉回流受阻所致的骨内静脉血淤积。据于此,有人结扎大鼠股静脉并切除1cm,且切断髂内静脉和躁部至膝部的大隐静脉,8周后可见关节软骨的钙化层增厚,新骨形成,松质硬化,与临床OA的变化相似。结扎犬膝关节周围的静脉可导致关节软骨的局部损伤和变性。通过结扎家兔一侧股、臀下静脉造成膝关节周围骨内高压动物模型,1周时关节软骨出现退变。许氏等认为这种方法造模12周时关节软骨仅呈轻微病变,与临床表现不太相符,而采用在结扎股、臀下静脉的同时行同侧肢体伸膝固定的2种方法叠加造模,既能使膝旁周围静脉瘀滞,骨内压升高,又能使兔膝关节发生退行性改变,术后6周模型即可建成,造模成功率高。而且可以观察到兔膝关节明显退变、软骨表层明显缺损、关节软骨溃疡、软骨细胞紊乱和软骨细胞丢失、纤维化及少量骨赘形成等,符合人类骨关节炎的病理改变。

    2.3 药物注射诱发骨关节炎模型

    1.木瓜蛋白酶(Papain)  Papain是一种蛋白水解酶,将其分别注入家兔膝、髋关节中,并加以局部制动,观察到关节软骨退行性变的发生。杨氏等用1.6%Papain 0.3ml注入日本大耳兔颞颌关节控制内,2, 4, 6周后,分别进行病理学观察,发现关节软骨变薄,表面糜烂、腐蚀,软骨细胞坏死,软骨基质破坏等一系列的病理性改变,这种模型与人类OA病理变化极为相似,且易于复制。同样,用4%Papain 0.3ml注射到家兔髋关节中也成功地复制出OA模型,且骨关节炎发生时间短,重复性好。

    2.胶原酶  胶原酶是一种金属蛋白酶,能够分解细胞间基质的胶原蛋白。Kikuchi等利用胶原酶注入兔膝关节腔内,6周后发现骨的边缘比中间更为严重,软骨的退变随时间的推移而逐渐加重,且与胶原酶剂量呈正相关,这种关节软骨的退变与人类OA病理相类似,并认为在短时间内这种造模方法比木瓜蛋白酶更易诱导OA。

    3.雌二醇  雌二醇可导致关节软骨受损,实验研究发现,在家兔和狗的关节软骨细胞内存在17-β雌二醇受体,表明雌激素与OA发生有密切关系。Tsai等将雌二醇按0.3mg/(kg·d)的剂量注入兔膝关节腔内,9周后发现兔股骨髁表面关节软骨变薄,软骨面龟裂、纤维化;12周后关节软骨侵蚀破坏扩展到钙化层,软骨下骨外露,电镜扫描进一步提示,软骨细胞变形严重呈不规则状,细胞核深度凹陷窝出现及囊泡形成。

    4.聚乙烯亚胺  OA早期,蛋白多糖在关节软骨新陈代谢过程中退变和变异对OA的发生起关键作用。因此, Sakano等将阳离子聚乙烯亚胺注射到鼠膝关节腔内,用以阻挡膝关节软骨阴离子区域,2, 4, 6个月后观察发现,膝关节明显变形,蛋白多糖退变和功能减退,且逐渐加重,晚期发展成为典型的OA模型。这种OA模型的诱导与聚乙烯亚胺分子量呈正相关。此外,菲律宾素(Filipin)、肾上腺皮质激素、透明质酸、软骨碎片等注入家兔膝关节腔内,也可导致关节软骨退变,诱发OA模型。

    2.4 骨关节炎转基因动物模型

    (1)复制方法  OA是一种由多种原因所致的慢性退行性关节病变,以关节软骨变性、破坏及骨质增生为主要特征。主要复制方法是:通过转基因和基因敲除技术获得自发性OA动物模型。

    (2)模型特点  ①Ⅱ型前胶原基因缺陷小鼠模型  正常软骨基质胶原以Ⅱ型为主,Ⅱ型胶原合成障碍与OA发病有关。OA软骨细胞Ⅱ型胶原合成功能受损,Ⅰ型胶原合成增加,因此,OA关节软骨胶原纤维构成更近似于皮肤和骨的胶原纤维,从而导致软骨表层胶原纤维直径变大,分布不规则,对软骨的保护作用减弱。据报道Ⅱ型前胶原基因点突变(半胱氨酸取代519位精氨酸,Arg→Cys 519)可导致家族性的OA,具全身性、侵蚀性及早发的特点,呈常染色体显性遗传,并伴有轻度的脊柱软骨发育不良。对儿童早发OA病例的调查也发现同样的点突变。表达人突变Ⅱ型前胶原基因(Arg→Cys 519)转基因小鼠模型比正常对照体积小、有腭裂且生长板紊乱,电镜下观察软骨示Ⅱ型胶原纤维密度降低,软骨细胞高尔基体囊扩张。以上改变类似于含Ⅱ型前胶原(COL-A1)突变基因患者所表现出的早发全身OA和软骨发育不良。COL-A1基因剔除小鼠模型同样存在软骨缺陷,该品系低龄小鼠表型与人类软骨发育异常类似,表现形式多样,可出现软骨基质胶原纤维数量减少、软骨细胞粗面内质网扩张、生长发育障碍,骨密度减低、易于骨折等;而高龄小鼠(15个月)则表现出典型的OA样软骨退行性变。研究发现,含失活的COL-A1等位基因的小鼠在15个月龄时,OA的发生率为60%~90%,而正常对照组只有20%~45%(P<0.01)。踩轮运动能降低其OA的发生率,但对正常小鼠OA的发生无影响。这可能与运动使关节软骨胶原纤维网重排和加强有关。

    ②双糖链蛋白多糖P纤维调节素相关基因缺陷小鼠模型  双糖链蛋白多糖是富含亮氨酸的Ⅰ类小分子蛋白多糖(SL-RP),其编码基因位于Xq28-ter,与核心蛋白多糖(decorin,另一种Ⅰ类SLRP)编码基因同源。双糖链蛋白多糖在靠近N末端部位连有2条硫酸软骨素氨基葡聚糖链,而核心蛋白多糖只有1条。纤维调节素是Ⅱ类SURP,在骨、软骨组织和肌腱中表达较高。研究表明,双糖链蛋白多糖基因敲除小鼠骨前体细胞形成障碍且对TGF2β反应低下,胶原合成减少,细胞凋亡增加。双糖链蛋白多糖P纤维调节素基因联合缺陷小鼠肌腱胶原纤维在结构和机械性能上均发生改变,引起关节不稳定,出现步态改变、肌腱异位钙化,导致发生严重早发并快速进展的OA;如受累关节被迫运动,则病理改变更为明显。

    (3)比较医学  临床人类骨关节炎发病与年龄、体重、炎症、外伤、遗传等多种因素有关,无明显地域及种族差异,它是人类致残的重要病因之一。目前,临床上对OA尚缺乏有效的根治措施,通过建立理想的OA动物模型,来开展其发病机制、药物治疗方面的实验研究是研究OA的重要方法之一。

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