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    自身免疫性内耳病动物模型

    点击次数:1006 发布时间:2018-03-30

                      自身免疫性内耳病动物模型

    (1)复制方法  取4周龄近交系雄性C57BL/6小鼠,以及体重为300~400g,经检查耳郭反射正常,无中耳感染的豚鼠。豚鼠麻醉后心脏灌注,断头取颞骨,在4℃无菌含1mg/L抑肽酶的10mmol/L Tris缓冲液中剥离全部内耳膜性组织,匀浆。匀浆液离心,取上清液-20℃冻存;沉淀在含0.5%十二烷基硫酸钠、0.5%β-巯基乙醇、1%甘油、2mmol/ L苯甲丨基丨磺丨酰丨氟、10mmol/L N-己基顺丁烯二甲亚胺的50mmol/L Tris缓冲液中匀浆,计算蛋白含量,-80℃分装冻存。用制备的内耳抗原(Inner Ear Antigen, IEAg)免疫小鼠,每只模型小鼠颈背部皮下多点注射IEAg弗氏佐剂(Complete Freund Adjuvant, CFA)乳剂,足背皮内注射百日咳减毒活菌50μl(含25×1000000000个菌体),IEAg含量为100μg。免疫后作小鼠双侧耳听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)测试:动物麻醉后置声、电屏蔽室内,采用诱发电位仪测试。取刺激声0.1ms为短声,间隔时间为50ms,滤波100~3000Hz,扫描时间为10ms,叠加500次。低于刺激声30dB的白噪声对侧耳作掩蔽。以波Ⅱ的反应阈为标准判断ABR的反应阈。分别在造模后7、14、21、28d检测动物血清中抗IEAg抗体,并取颞骨组织,制作内耳组织常规切片,HE染色后,光镜下观察。

    (2)模型特点  经IEAg免疫后2周内模型动物体重呈进行性下降,免疫3周后体重可恢复至免疫前水平,并缓慢增加;动物尚可出现活动减少、耳廓反射不敏感、走路不稳等临床表现。造模前C57BL/6小鼠ABR反应阈均值为46dB SPL,左、右耳无显著性差异;造模后第7日动物ABR反应阈即显著提高。模型动物镜下病理组织学观察显示,内耳组织中鼓阶、蜗管、前庭阶及蜗轴血管周围有较多炎症细胞浸润,造模后前2周可见较多内淋巴积水;并可见螺旋神经节细胞肿胀及坏死样改变,细胞数量在免疫后进行性减少。本模型应用豚鼠IEAg造模后,且模型动物听力改变与细胞浸润程度及血清抗IEAg抗体水平呈显著性正相关,提示免疫和体液反应在诱发自身免疫性内耳病(autoimmune inner ear disease, AIED)时可能起重要作用。

    (3)比较医学  自身免疫性内耳病在临床上目前仍然发病机制不明,也无特异性实验室检查指标,且治疗原则存在争议、治疗效果不理想。建立与临床AIED相似的疾病动物模型,有助于阐明自身免疫性内耳病的发病机制及分析内耳的免疫调节治疗效果。以往的研究报道大多数实验性 AIED均以远交系豚鼠作为实验动物,采用初次系统免疫后多次加强免疫的方式,通过机体产生的自身抗体经体液免疫介导免疫反应而诱发。这些模型成功率较低(20%~50%);听力损害程度较轻(8~25dB);内耳病理改变不典型;多次加强免疫的实验周期较长,增加了实验中不确定因素对实验结果的影响。由于远交系动物在可重复性及免疫学分析的细节研究方面均较近交系动物差,所以这些模型并不能准确反映人类AIED的发病机制以及病理生理改变。本模型采用内耳抗原免疫动物后出现显著的听力下降,听力损害程度随免疫进程而不断加剧,血清中可检测到抗内耳组织的自身抗体,这些变化与临床上AIED患者的表现一致;形态学上表现的血管周围炎等特征性自身免疫性损害可进一步证实。 C57BL/6小鼠作为一种广泛使用的近交系小鼠,其个体间极为一致,且对实验反应也一致,可以消除杂合遗传背景对实验结果的影响。C57BL/6小鼠随年龄增加可表现出与高频相关的老年性听力下降,因此这种动物模型被用于研究老年性耳聋。采用本方法诱导的AIED模型,具有发病率高,听力损害程度严重,内耳病理改变典型,造模周期短,制作方法简便,实验条件比较简单,其他因素容易控制的优点。

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