招聘服务

Products

产品中心

  • 实验技术服务

  • 细胞株

  • Elisa试剂盒

  • 首页>技术文章>实验助手——质粒图谱如何“瞅”

    技术文章 Article

    实验助手——质粒图谱如何“瞅”

    点击次数:3496 发布时间:2017-09-28

    每当拿到一个质粒图谱,是不是一下就有点懵了?这些ori、RBS、tet是什么?这些箭头代表什么,转录的方向吗?不要着急,剑钝生物把这些告诉你,也许会解决你的困惑。

    质粒和载体傻傻分不清楚
    质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都是环状构型。

    载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。细菌或病毒质粒是重组DNA技术中常用的载体。

    简而言之,质粒可以说是一个统称,载体是质粒改造过用来运载的工具

    选用质粒做载体的要求
    以常用的为例
    (1)选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);
    (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般 10 个以上的拷贝,而严谨型质粒<10 个。
    (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;
    (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr。
    无论选用哪种载体,先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。

    如何一眼看穿质粒图谱
    ①  复制起始位点Ori,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒),Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。

    ②  再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记:
    Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。
    tetr :可以阻止四环素进入细胞。
    camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。
    neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。
    hygr:使潮霉素β失活。

    ③  看多克隆位点(MCS):它具有多个限制内切酶的单一切点(质粒上只能有该内切酶的*酶切序列,不然就一刀好几段了),便于咱们要研究的基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选,常见的是β-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统。

    ④再看外源DNA插入片段大小:质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA的片段。一般来说,外源DNA的片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

    ⑤ 是否含有表达系统元件,即启动子(promoter)-核糖体结合位点(RBS)-转录终止信号(AATAAA同时是poly A)。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。

    ⑥看报告基因:主要是为了能迅速检查功能基因是否表达的阳性判断,表达成功的蛋白在小鼠体内分布位置。
     
    ⑦看质粒图谱上的箭头:它代表DNA两条链(正义链和反义链),即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上。
    目的基因片段进行连接。

    返回

    网站首页/关于我们

    新闻动态/技术文章

    产品中心 /荣誉与资质

    在线留言/联系我们

    JRD263蛋白组学服务

    JRD398原代细胞分离实验

    JRD272Western blot蛋白技术服务

    JRD290代谢组学价格

    联系电地:上海市长江南路180号长江软件园B区B636号

    点击这里给我发消息
     

    沪公网安备 31011302005922号